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背景乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤。虽然乳腺癌治疗方式在不断创新,但化疗仍占主要地位。临床上应用的化疗药物常存在中性粒细胞减少、衰老等副作用,因此,亟待开发一种用于乳腺癌治疗的低毒高效的药物。攀登鱼藤异黄酮是从拓树果实中提取分离出的一种黄酮类化合物,具有抗氧化、降血压和抗癌活性。细胞自噬和凋亡作为细胞程序性死亡形式在肿瘤防治中发挥重要作用。攀登鱼藤异黄酮是否通过诱导乳腺癌细胞自噬和/或凋亡发挥其抗乳腺癌作用?具体机制如何?尚未清楚。目的探讨攀登鱼藤异黄酮抗乳腺癌作用及其分子机制,为研发攀登鱼藤异黄酮为抗乳腺癌药物提供理论基础。方法1.采用MTT法和细胞周期试剂盒检测攀登鱼藤异黄酮对不同类型乳腺癌细胞增殖活性的影响;2.采用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI染色以及蛋白印迹法检测攀登鱼藤异黄酮是否诱导乳腺癌细胞凋亡;3.利用MDC染色、蛋白印迹法和免疫荧光染色等检测攀登鱼藤异黄酮是否诱导乳腺癌细胞自噬;4.Mito-tracker Red染色线粒体,共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察乳腺癌细胞内线粒体形态变化;利用线粒体膜电位检测试剂盒和活性氧检测试剂盒分别检测乳腺癌细胞线粒体膜电位和活性氧变化;5.Mito-tracker Red 染色线粒体,LysoTracker Green 染色溶酶体以及 LC3、PINK1和Parkin免疫荧光染色后,共聚焦显微镜观察乳腺癌细胞内线粒体和溶酶体或LC3共定位情况,PINK1和Parkin蛋白表达和共定位情况;蛋白印迹法和PCR检测乳腺癌细胞PINK1和Parkin mRNA和蛋白表达情况。结果1.攀登鱼藤异黄酮可抑制乳腺癌细胞增殖攀登鱼藤异黄酮在20μM 24h、15μM 24h、20 μM 24h和15 μM 24h即可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF7、ZR75-1和SKBR3增殖(P<0.001;P<0.001;P<0.001;P<0.001)。攀登鱼藤异黄酮在20 μM 24h即可阻滞MDA-MB-231细胞在G1期(P<0.05)、而MCF7细胞则阻滞在S/G2期(P<0.001)。2.攀登鱼藤异黄酮诱导乳腺癌细胞凋亡20 μM攀登鱼藤异黄酮作用于MDA-MB-231细胞24h即可显著增加细胞凋亡率(P<0.01),10μM攀登鱼藤异黄酮处理MCF7细胞24h即可显著增加凋亡率(P<0.05)。30μM攀登鱼藤异黄酮作用于乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF7)24h后,可显著下调PARP蛋白表达(P<0.001;P<0.05),上调Bax/Bc1-2蛋白表达比值(P<0.05;P<0.01)诱导乳腺癌细胞凋亡。3.攀登鱼藤异黄酮诱导乳腺癌细胞自噬20 μM攀登鱼藤异黄酮处理乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF7)12h,细胞内酸性囊泡增加,自噬标记性蛋白LC3 Ⅱ(P<0.01;P<0.01)和P62(P<0.01;P<0.001)表达均显著上调。20 μM攀登鱼藤异黄酮处理乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF7)12h,共聚焦荧光显微镜下可见细胞内LC3蛋白表达上调。然而,利用自噬抑制剂氯喹和3-甲基腺嘌呤抑制自噬后,攀登鱼藤异黄酮处理乳腺癌细胞12h后,MDA-MB-231细胞内PARP蛋白进一步显著下调(P<0.001;P<0.001),而MCF7细胞内PARP蛋白变化不明显。4.攀登鱼藤异黄酮促发乳腺癌细胞ROS产生及线粒体损伤20 μM攀登鱼藤异黄酮处理MDA-MB-231细胞12h后,线粒体形态发生变化,由长丝状变为短粒状,线粒体嵴损伤甚至消失,并且线粒体膜电位下降。30 μM攀登鱼藤异黄酮处理MDA-MB-231细胞12h可显著上调细胞内线粒体来源的ROS水平(P<0.05)。此外,20 μM攀登鱼藤异黄酮可显著增加MDA-MB-231细胞线粒体质量(P<0.001),而利用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸抑制ROS产生后,线粒体质量显著下调(P<0.05)。5.攀登鱼藤异黄酮诱导乳腺癌细胞线粒体自噬20 μM攀登鱼藤异黄酮处理乳腺癌细胞12h,MDA-MB-231和MCF7细胞内线粒体和溶酶体、线粒体和LC3之间均存在明显的共定位现象。透射电子显微镜下可见攀登鱼藤异黄酮处理组MDA-MB-231和MCF7细胞内存在被双层囊泡包裹着的线粒体,即线粒体自噬体。6.攀登鱼藤异黄酮通过PINK1/Parkin信号通路促发乳腺癌细胞线粒体自噬30 μM攀登鱼藤异黄酮作用于MDA-MB-231细胞12h,PINK1和Parkin mRNA表达均显著上调(P<0.05;P<0.01);攀登鱼藤异黄酮可呈浓度依赖性上调PINK1和Parkin蛋白表达(P<0.01;P<0.01),共聚焦显微镜下可见PINK1和Parkin蛋白之间存在明显的共定位现象。结论1.攀登鱼藤异黄酮可抑制乳腺癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡和自噬,而抑制自噬增强其促凋亡作用。2.攀登鱼藤异黄酮可促发乳腺癌细胞ROS产生增加,并诱导线粒体损伤和线粒体自噬。3.PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬参与攀登鱼藤异黄酮抗乳腺癌作用。