论文部分内容阅读
背景和目的:葡萄膜炎是常见的致盲率高的自身免疫性眼病。在我国,Vogt-小柳原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome,VKH)是常见的一种葡萄膜炎类型。但该综合征的发病和进展机制仍不十分清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一类小的、非编码RNA,通过碱基互补配对结合在编码基因mRNA的3’UTR区(untranslated region,UTR)参与基因转录后表达调控。研究显示MicroRNA-20a-5p(miR-20a-5p)参与调控多发性硬化疾病的发病和进展,暗示了 miR-20a-5p参与自身免疫性疾病进程的调控。因此,我们想探索miR-20a-5p是否参与调控Vogt-小柳原田综合征的发病和进展。本研究拟探讨miR-20a-5p在Vogt-小柳原田综合征中的作用及机制。旨在Vogt-小柳原田综合征中揭示一个新的关于miRNA的调控信号通路,为理解疾病的发生发展提供新的思路。方法:1.分别抽取活动期Vogt-小柳原田综合征患者和正常人的外周静脉血,并分离他们的CD4+T细胞;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测两组人群CD4+T细胞中miR-20a-5p的表达水平;2.利用亚硫酸盐测序法(BSP)检测活动期Vogt-小柳原田综合征患者和正常人CD4+T细胞中miR-20a-5p启动子CpG岛甲基化状态;3.利用miRNAs 基因数据库OmicsBean预测miR-20a-5p的靶基因;利用双荧光素酶实验验证miR-20a-5p对候选靶基因mRNA3’UTR的抑制作用;利用免疫印迹技术(Western Blot)检测miR-20a-5p对靶基因蛋白表达的抑制作用;4.利用流式细胞术(FCM)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测体外转染 miR-20a-5p mimics,miR-20a-5p inhibitor 及共转miR-20a-5p/OSM 或 miR-20a-5p/CCL1 后,活动期 Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞Th17和Th1的细胞比例以及分泌的细胞因子IL-17和IFN-y的水平;5.利用Western Blot检测不同处理组CD4+T细胞中PI3K-AKT信号通路主要蛋白的表达情况。结果:1.qRT-PCR结果显示:与正常人相比,活动期Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞中miR-20a-5p表达明显降低。FCM结果显示:miR-20a-5p mimics 可减少 Th17 细胞比例,而 miR-20a-5p inhibitor 显示了相反的作用。ELISA结果显示:miR-20a-5p mimics抑制CD4+T细胞中IL-17的表达,反之亦然。2.BSP测序结果显示:与正常人相比,活动期Vogt-小柳原田综合征患者的miR-20a-5p启动子区域CpG岛甲基化比率较高,而甲基化抑制剂(5-Aza-2’-deoxycytidin)处理患者CD4+T细胞后,甲基化比率下降;一致地,qRT-PCR结果显示5-Aza-2 ’-deoxycytidin处理患者CD4+T细胞后miR-20a-5p表达回升。3.OmicsBean 软件预测出 OSM,CCL1 及 SEMA7A 为 miR-20a-5p的靶基因;双荧光素酶实验结果显示过表达miR-20a-5p显著抑制293T细胞中OSM和CCL1的3’UTR区荧光素酶活性;一致地,过表达miR-20a-5p可抑制患者CD4+T细胞中OSM和CCL1蛋白表达。4.转染了 miR-20a-5p mimics后的CD4+T细胞Th17细胞比例和IL-17分泌显著减少,而转染了 miR-20a-5p inhibitor后的CD4+T细胞Th17细胞比例和IL-17分泌显著增多。重要的是,过表达miR-20a-5p导致CD4+T细胞Th17细胞比例和IL-17分泌减少的作用可被OSM和CCL1的重新表达所逆转。5.Western Blot显示过表达miR-20a-5p显著增加CD4+T细胞中磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达,而沉默miR-20a-5p显示了相反的作用。重要的是,OSM和miR-20a-5p共转染后,miR-20a-5p过表达导致p-PI3K和p-AKT蛋白增加的作用被减弱。此外,沉默miR-20a-5p导致p-PI3K和p-AKT蛋白减少的作用可被PI3K-AKT信号通路抑制剂(LY294002)的加入所逆转。结论:我们发现在活动期Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞中miR-20a-5p的表达明显降低,降低的miR-20a-5p水平是由于其启动子区域高甲基化造成的。我们揭示了 miR-20a-5p可抑制CD4+T细胞Th1 7的细胞比例和IL-17的分泌。重要的是,miR-20a-5p的这种作用是通过抑制OSM和CCL1来实现的。此外,我们还发现miR-20a-5p可以抑制PI3K-AKT信号通路活性从而抑制CD4+T细胞IL-17的产生。