双光子荧光显微成像技术已逐渐成为生命科学尤其是神经科学研究中的重要技术。但是双光子荧光显微成像是一种扫描成像技术,其时间分辨率不高,不能很好地满足功能生物学研究中对于快速变化功能信号的检测需求。作者采用只对感兴趣区域进行扫描的随机扫描模式来解决双光子荧光显微成像技术的时间分辨率问题,实现了随机扫描双光子荧光显微成像系统。本文对系统中主要问题的研究进行了论述。研究了利用声光偏转器的随机扫描能力提高感兴趣区域信号获取的时间分辨率的方法。通过将扫描位置限制于若干感兴趣区域,利用声光偏转器的高速扫描定位能力缩短扫描时间,将更多的时间用于荧光信号的积累和平均,从而提高有效的时间分辨率,同时又保证一定的信噪比。提出了新的单棱镜色散补偿方法解决声光偏转器对超短脉冲激发光的色散问题。引入单个棱镜补偿声光偏转器的空间色散,并将声光偏转器同时作为时间色散补偿单元的组成部分,从而利用棱镜和声光偏转器所组成结构的角色散引入的时间色散补偿了声光偏转器自身材料色散引入的时间色散。采用舍弃初始数据段的方法,解决了声光偏转器中扫描定位与扫描控制信号之间的延时带来的信号错位问题。分析了利用LabVIEW进行系统软件的快速开发中存在的问题,设计了便于实现和维护的LabVIEW程序框架。将随机扫描系统应用于脑片钙荧光成像中,验证了神经元高频动作电位发放与钙荧光信号之间的对应关系。分析了系统实际应用中的噪声来源问题,指出在生物学实验中的荧光信号水平下,散粒噪声是主要的噪声来源。设计并实现的随机扫描双光子荧光显微成像系统在充分利用物镜的数值孔径时,对于60X油镜(数值孔径为1.42),可以达到0.3μm的横向分辨率和1.3μm的纵向分辨率。并且在样品处功率相同的情况下,使用了色散补偿之后的荧光信号强度为色散补偿前的15倍左右。最高扫描速度达到每扫描点10微秒,是普遍采用的扫描镜扫描成像速度的100倍左右,能够以单个动作电位的分辨率观察到神经元上感兴趣区域内对应于50 Hz动作电位发放的钙荧光信号的变化。