【摘 要】
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溶藻弧菌广泛分布于全球海洋和河口处,适应力极强,是一种常见的条件致病菌,可感染多种海水经济养殖动物,主要经动物的黏膜、受伤的表皮或肠道侵染致病。环二鸟苷酸（c-di-GMP）广泛存在细菌中常见的细菌第二信使,调控细菌的生物被膜形成、毒力、运动及细胞分化等各种生理活动。研究表明,c-di-GMP在细菌致病过程中发挥了重要作用,并参与调控细菌的多种生理代谢过程。目前,c-di-GMP在溶藻弧菌中研究较
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溶藻弧菌广泛分布于全球海洋和河口处,适应力极强,是一种常见的条件致病菌,可感染多种海水经济养殖动物,主要经动物的黏膜、受伤的表皮或肠道侵染致病。环二鸟苷酸（c-di-GMP）广泛存在细菌中常见的细菌第二信使,调控细菌的生物被膜形成、毒力、运动及细胞分化等各种生理活动。研究表明,c-di-GMP在细菌致病过程中发挥了重要作用,并参与调控细菌的多种生理代谢过程。目前,c-di-GMP在溶藻弧菌中研究较少,对其参与调控的机制尚不清楚。因此,本研究旨在研究溶藻弧菌参与c-di-GMP代谢的基因和受体,以及其参与调节的生理活动及调控机制。基于此,本研究对溶藻弧菌HY99001菌株进行了基因组全长序列测序,筛选与c-di-GMP相关的代谢酶基因,并使用生物素标记的c-di-GMP与溶藻弧菌全菌蛋白进行pull down实验,通过质谱鉴定找出与c-di-GMP特异性结合的受体蛋白;表达纯化含HD-GYP结构域的c-di-GMP降解酶VAGM003125蛋白,并与c-di-GMP分子孵育,LC-MS/MS色谱串联质谱分析鉴定蛋白功能;利用同源重组技术,构建框内缺失株ΔVAGM003125,分析缺失株的生物特征变化,并经靶向代谢组分析野生株HY9901与ΔVAGM003125缺失株c-di-GMP组间浓度差异,经转录组测序后,分析显著差异基因和差异基因富集的代谢通路;表达纯化鞭毛转录因子FlrA蛋白,与c-di-GMP分子pull down鉴定其是否属于c-di-GMP转录因子受体,并通过EMSA和β-半乳糖苷酶报告基因研究c-di-GMP分子通过与转录因子FlrA互作从而负调控菌体鞭毛基因转录水平;最后,对ΔVAGM003125缺失株作为减毒活苗进行研究。研究结果如下:1.基因组测序结果,组装得到两个环形,基因组大小约为5,204,348 bp,注释到基因4,846个,通过多数据库注释,得到34个与c-di-GMP相关的基因,其中18个基因演绎的蛋白序列含GGDEF domain、8个含GGDEF-EAL domain、4个含EAL domain,4个含HD-GYP domain。利用生物素标记的c-di-GMP分子pull down溶藻弧菌HY9901全菌蛋白,经SDS-PAGE和银染分析得到差异条带,经质谱分析得到140个与c-di-GMP分子特异性结合的蛋白。2.通过多序列比对分析,溶藻弧菌含HD-GYP结构域的VAGM003125蛋白含有HHExx DGx GYP保守序列,预测其具有磷酸二酯酶活性,通过蛋白水解实验并利用LC-MS/MS分析确定VAGM003125蛋白有磷酸二酯酶活性,能水解c-di-GMP分子。利用同源重组技术成功构建了VAGM003125基因的框内缺失株ΔVAGM003125,通过生物特征分析得到,溶藻弧菌野生株HY9901与缺失株ΔVAGM003125形态特征和生长曲线没有显著差异;但ΔVAGM003125的泳动能力和毒力相比野生株显著下调,生物膜形成能力显著增加,推测VAGM003125蛋白参与调控溶藻弧菌的运动、生物膜形成以及毒力。3.通过靶向代谢组分析,ΔVAGM003125胞内c-di-GMP浓度对比野生株显著上调,进一步验证了VAGM003125为磷酸二酯酶,能水解c-di-GMP分子。RNA-seq结果分析得到显著差异基因（DEGS）共有831个,其中显著上调差异基因210个,显著下调差异基因621个。靶向代谢组联合转录组分析得到,VAGM003125基因的缺失导致胞内c-di-GMP浓度上调,并且与野生株相比的差异表达基因主要富集在双组分系统、鞭毛组装系统,氧化磷酸化系统、生物膜形成等代谢通路。4.表达纯化鞭毛转录因子FlrA蛋白,与生物素标记的c-di-GMP分子孵育后pull down证实FlrA蛋白能与c-di-GMP结合,揭示FlrA是c-di-GMP的转录因子受体;EMSA实验结果表明随着c-di-GMP的浓度上调,FlrA与flrB启动子的结合能力显著下降;结合β-半乳糖苷酶报告基因实验结果,表明c-di-GMP分子结合转录因子FlrA负调控菌体鞭毛基因转录水平。5.ΔVAGM003125作为减毒活苗免疫珍珠龙胆石斑鱼,能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,获得较高水平的抗体,免疫保护率达到81%,是一种有效的候选疫苗。
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