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第一章：EGFR基因突变检测方法学比较及其影响因素分析[目的] 比较临床常用的两种方法检测晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变状态结果的差异,探讨福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded, FFPE)组织切片标本的不同保存方式对DNA数量、质量及对检测结果的影响。[方法]收集中国医学科学院肿瘤医院2010年11月至2011年8月晚期NSCLCFFPE组织切片标本150份,分别采用楔形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions amplification refractory mutation system, ARMS)和直接测序法检测EGFR第18、19、20、21号外显子突变状态,分析两种方法检测EGFR基因突变结果的差异,对结果不一致病例收集临床治疗情况及生存数据并进行分析。对其中30份FFPE标本提取DNA并保存于-20℃ 3年,同样的30份FFPE标本按常规方法保存3年后再提取DNA,比较两种保存方式对DNA的数量、质量及对检测结果的影响。[结果]Scorpions ARMS法检测EGFR基因突变的成功率(100%)高于直接测序法(87.3%),差异有统计学意义(χ2=20.28,P<0.05)。两种方法检测EGFR基因突变的一致率为87.0%,一致性较好(Kappa=0.738,P<0.001)。直接测序法共检测到7种ARMS试剂盒未包含的突变类型,其中19号外显子E746_S747>IP突变及20号外显子H773同义突变为新发现的突变类型。分析结果不一致病例中5例接受靶向药物治疗后患者的生存情况,与ARMS检测结果一致性相对较好。新鲜FFPE标本提取并贮存于-20℃ 3年的DNA与FFPE标本按常规方法保存3年后提取的DNA相比,后者质量相对较差,片段化程度更严重,但两种保存方法获取的DNA的EGFR基因突变检测结果均一致。[结论]ARMS法对EGFR基因突变的检测成功率较高且灵敏度较好。直接测序法可以检测到EGFR基因的少见突变类型。FFPE标本提取DNA后低温贮存,更有利于DNA完整性的保存。第二章：直接测序法与荧光PCR法检测结直肠癌患者KRAS基因突变的对比分析[目的]比较直接测序法和荧光定量PCR法检测结直肠癌KRAS基因突变状态结果的差异,探讨KRAS基因突变与结直肠癌患者临床病理特征的相关性。[方法]收集中国医学科学院肿瘤医院2010年8月至2011年12月结直肠FFPE组织切片标本200份,分别采用直接测序法和荧光PCR法检测KRAS基因外显子2中第12和13号密码子最常见的7种突变类型,将两种方法检测结果进行对比分析,对结果不一致病例采用蝎形探针扩增阻滞突变系统法(Scorpions amplification refractory mutation system,ARMS)进行验证。同时,收集患者临床资料,分析KRAS基因突变与结直肠癌患者临床病理特征的相关性。[结果]两种方法检测KRAS基因突变的总一致率为93.5%(187/200),一致性较好(Kappa=0.853,P<0.05)。当Ct值小于26、介于28/29～31之间、大于31时,荧光PCR法与直接测序法一致率较高,分别为96.8%、100%、100%。当Ct值介于26～28/29之间时,荧光PCR法与直接测序法一致率较低,为0.0%。KRAS基因突变与肿瘤的T分期有关(P=0.047),KRAS 13密码子突变与肿瘤分化程度有关(P=0.037)。[结论]在检测前对相应肿瘤区域进行划分,只刮取肿瘤组织进行DNA的提取,能使直接测序法检测KRAS基因突变的结果更加准确、可靠。对于荧光PCR检测结果图中扩增曲线有升起但Ct值大于26的标本,建议复测或更换检测方法进行验证。