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随着人民生活水平的不断提高和生活方式的改变,代谢综合征作为一个独立的疾病引起了广泛的关注,其发病率以较快的速度增长。代谢综合征是一组临床症候群,其共同的病理生理基础是胰岛素抵抗和高胰岛素血症,因此又称为胰岛素抵抗综合症。依据1998年WHO专家委员会对代谢综合征的诊断标准,上海社区20-74岁人群中代谢综合征的患病率为17.14%。美国全国健康和营养调查资料(1999-2000年)显示代谢综合征标化和非标化发病率为26.7%和27.0%。因此代谢综合征已成为严重危害人民健康的常见病和多发病。目前对代谢综合征分子机制的了解还处于初级阶段。近年来对代谢综合征研究关注的重点是伴发的心血管系统疾病,相对而言与肿瘤的关系关注较少。Ⅱ型糖尿病是代谢综合征最常见的临床表现,目前关于Ⅱ型糖尿病与肿瘤发生之间的关系已有大量的流行病学研究并取得一致性的结果。肥胖和体重超重可以增加恶性肿瘤的发病率和死亡率,特别是结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌等。Ⅱ型糖尿病病人发生结直肠癌的风险升高(结肠癌的相对危险度RR为1.49)。接受胰岛素治疗的Ⅱ型糖尿病病人较不需要胰岛素治疗的糖尿病病人,结直肠癌发生的危险度增大,且危险度与胰岛素应用的时间长短有关。这些研究提示架接代谢综合征/Ⅱ型糖尿病和肿瘤的桥梁是高胰岛素血症,但迄今为止,高胰岛素血症在肿瘤发生过程中的具体机制因缺乏深入研究而仍未明确。IGFBP-rP1是我们实验室在1999年用抑制性差减杂交法(SSH)构建的结直肠腺癌相对正常粘膜(T-N)文库中筛出、在腺癌中高表达的一个基因。目前认为IGFBP-rP1与肿瘤关系密切。除个别研究报道IGFBP-rP1在乳腺癌、前列腺癌中表达上调外,大部分报道认为IGFBP-rP1在多种人类肿瘤,如脑膜瘤、肺癌、肝癌等中均存在表达下调的现象。体外实验证实IGFBP-rP1能通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤的生长和进展。现有文献均支持IGFBP-rP1在结直肠癌组织中的表达高于正常组织,提示IGFBP-rP1在结直肠癌的发生发展中可能起着重要作用。我们在前期工作中还发现结直肠癌组织中IGFBP-rP1的表达与病人的空腹血糖浓度呈正相关,在4例合并Ⅱ型糖尿病的结直肠癌病人的肿瘤组织中IGFBP-rP1均呈现高表达,提示IGFBP-rP1参于Ⅱ型糖尿病和结直肠癌的发生发展。作为一个分泌蛋白,Yamanaka等研究发现IGFBP-rP1可以与胰岛素高亲和力的结合,抑制胰岛素发挥正常的生物学作用,进一步说明IGFBP-rP1与Ⅱ型糖尿病之间存在密切联系。这些研究发现IGFBP-rP1与肿瘤、Ⅱ型糖尿病的发生有关,提示IGFBP-rP1可能是联系肿瘤与Ⅱ型糖尿病的关键因子。本课题旨在通过两部分研究,探索IGFBP-rP1与结直肠癌、Ⅱ型糖尿病之间的关系以及IGFBP-rP1在结直肠癌发展过程中的生物学作用。结直肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。近几年全球结直肠癌的发病率急剧上升,在西方发达国家居民恶性肿瘤死因顺位中结直肠癌位居第二。在我国随着居民生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌的发病率基本呈上升趋势,在恶性肿瘤中结直肠癌的发病率居第三、四位左右。因此对结直肠癌发病机制以及防治策略的研究具有十分重要的现实意义。目前关于结直肠癌的诊治还没有取得突破性进展,提高早期结直肠癌的诊断率是当前结直肠癌防治工作的重点。通过血清ELISA检测发现,正常人群血清中IGFBP-rP1与年龄、性别等各参数之间不存在相关性,但其与结直肠癌的发生呈正相关,IGFBP-rP1浓度越高,患结直肠癌的可能性就越大。多步回归分析也指出IGFBP-rP1与结直肠癌密切相关。这些结果提示有望通过IGFBP-rP1血清学检查对结直肠癌进行筛查。胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的发病基础。IGFBP-rP1作为胰岛素样生长因子结合蛋白家族的一个成员,可以和胰岛素以高亲和力结合,抑制胰岛素与其受体结合,阻碍胰岛素发挥正常生物学作用,从而引起“胰岛素抵抗”现象。我们发现Ⅱ型糖尿病病人中IGFBP-rP1浓度显著高于正常人群,其血清浓度是正常对照的700倍左右。进一步分析发现IGFBP-rP1与Ⅱ型糖尿病之间密切相关。与血糖一样,IGFBP-rP1可以作为Ⅱ型糖尿病检测的血清学指标。体外实验发现,胰岛素可以诱导结直肠癌细胞表达IGFBP-rP1,说明IGFBP-rP1可能通过胰岛素/胰岛素抵抗而与Ⅱ型糖尿病相关。通过第一部分的研究我们发现IGFBP-rP1确实与结直肠癌、Ⅱ型糖尿病密切相关,IGFBP-rP1可以作为Ⅱ型糖尿病的血清学检测指标。IGFBP-rP1可能通过胰岛素抵抗联系结直肠癌和Ⅱ型糖尿病。但迄今为止,IGFBP-rP1在结直肠癌和Ⅱ型糖尿病中的确切作用机制还不明了,在下一部分中我们选取IGFBP-rP1在结直肠癌中的生物学作用进行重点研究。我们将IGFBP-rP1 cDNA转染到两株具有不同遗传背景、不表达内源性IGFBP-rP1的结直肠癌细胞系RK0和CW2中,RT-PCR以及细胞分泌上清Western blot证实了IGFBP-rP1的表达后,对IGFBP-rP1在结直肠癌细胞中的生物学效应展开一系列研究。细胞划痕迁移实验和transwell小室侵袭实验显示:IGFBP-rP1对结直肠癌RKO、CW2细胞的侵袭迁移能力没有影响。细胞铺板划痕后每天对划痕宽度进行测量。划痕宽度改变差异在转染前后两株结直肠癌细胞系中并不明显。同时我们也观察到转染前后结直肠癌细胞株的侵袭能力没有发生明显改变。在transwell小室侵袭实验中,转染前后两株细胞系均未向基底膜下侵袭。但通过对转染IGFBP-rP1前后细胞粘附分子表达检测却发现,IGFBP-rP1可以降低E-cadherin和β-catenin的表达(p＜0.05)。E-cadherin和β-catenin的差异表达与细胞侵袭迁移能力未发生改变生物学行为不相一致,说明E-cadherin和β-catenin并非是细胞迁移活动能力增强的原因,而是IGFBP-rP1在结直肠癌细胞中发挥生物学作用过程中伴随的现象。MTT结果显示:IGFBP-rP1可以抑制结直肠癌细胞的生长。转染IGFBP-rP1后的RKO、CW2细胞的生长速度明显要慢于转染空载体对照组(RKO:p=0.008;CW2:p=0.03)。碘化丙锭(propidium iodide,PI)单染流式细胞术检测发现转染IGFBP-rP1后,细胞出现G1期阻滞。IGFBP-rP1-RKO VS对照:G1 76.1%VS61%,p＜0.05;IGFBP-rP1-CW2 VS对照:G1 14.1%VS0.83%,p＜0.05。衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase staining,SA-β-gal)染色显示:IGFBP-rP1能够诱导细胞发生衰老样改变。转染IGFBP-rP1后SA-β-gal染色呈阳性的结直肠癌RKO、CW2细胞明显增多(RKO:p=0.034;CW2:p=0.029)。Western blot结果显示,转染IGFBP-rP1后出现p53和p16/p21蛋白在细胞内积聚,同时伴随磷酸化RB蛋白的表达下降。这些结果提示IGFBP-rP1可能通过p53和pRB信号通路诱导结直肠癌细胞衰老。我们发现IGFBP-rP1在结直肠癌细胞中确实存在诱导细胞衰老的生物学效应,进一步明确了IGFBP-rP1在结直肠癌中抑癌的生物学作用。IGFBP-rP1在结直肠癌中发挥抑癌作用,但是在血清中IGFBP-rP1的表达与结直肠癌呈正相关,同时肿瘤组织中存在IGFBP-rP1的高表达,我们认为是机体微环境在对抗肿瘤的过程形成抑癌基因IGFBP-rP1高表达的现象,IGFBP-rP1仍发挥抑癌的生物学作用。引起该现象的确切原因还有待进一步证实。通过以上关于IGFBP-rP1在结直肠癌细胞的生物学功能研究以及血清学检测分析,我们得出以下结论:1、IGFBP-rP1可能可以作为结直肠癌和Ⅱ型糖尿病诊断的辅助指标,其可能是架接结直肠癌和Ⅱ型糖尿病发生之间的一个关键因子。2、IGFBP-rP1可以通过p53、pRB信号通路诱导结直肠癌细胞衰老而抑制细胞生长,在结直肠癌中扮演着抑癌基因的角色。