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目前发酵木质纤维素生产燃料乙醇最优良的菌株为酿酒酵母,天然酿酒酵母(Saccharomyces cerevisaae)存在不能发酵木糖生产乙醇的缺陷,但能够发酵木酮糖,所以必须对酿酒酵母进行基因工程改造:向酿酒酵母中引入酵母菌的木糖代谢途径,将木糖转化为木酮糖从而代谢木糖。但这种代谢方式往往表现出木糖醇的积累和乙醇产量不理想的问题,而高效表达木糖醇脱氢酶基因(XYL2)是提高木糖发酵菌株效率的一个必要条件。因此,本论文选取实验室已经分离鉴定出三种代谢木糖效果较高的酵母菌株,即库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii/Issatchenkia orientalis)德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbreckiI)和季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii),扩增出其编码木糖醇脱氢酶的基因,构建出能够利用木糖醇的酿酒酵母重组菌株,对木糖醇脱氢酶基因表达的蛋白酶性质进行研究,并以本实验室分离得到的热带假丝酵母SHC-3(Candida tropicalis)和已有报道的树干毕赤酵母CBS6054(Pichia stipitis)作为对照。目的是筛选出活性好、能够耐受发酵环境中高温和酸性的木糖醇脱氢酶。该研究获得了以下结果:(1)本实验将三种未有报道的木糖醇脱氢酶基因与pYES2/NT-B质粒连接构建出重组质粒导入酿酒酵母工程菌INVscl中表达木糖醇脱氢酶,并将基因片段进行测序分析。结果表明:这三种实验重组菌株和两种对比重组菌株都能够成功表达木糖醇脱氢酶,并且具有代谢木糖醇的能力;通过蛋白序列比对发现五种酶都属于中链脱氢酶家族(MDR),同时在目的蛋白氨基酸序列中有一个相似的锌离子结合区域和辅酶结合区域具有一定的保守性,而其他区域具有较大的差异,也具有明显的特异性。(2)本实验将三种木糖醇脱氢酶基因与荧光蛋白质粒导入酿酒酵母菌株中,诱导绿色荧光蛋白表达并观察其表达的部位,并与已知的两种木糖醇脱氢酶进行比较。结果表明:本实验研究的三种木糖醇脱氢酶基因的表达位置与热带假丝酵母和树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶均在细胞浆内,细胞核内和细胞壁均不能看见荧光反应,说明实验使用的五种木糖醇脱氢酶都属于胞浆蛋白。(3)对三种木糖醇脱氢酶进行各种性质的研究,以树干毕赤酵母和热带假丝酵母为对照,同时补充一些深入研究的酶活性质。结果表明:五种木糖醇脱氢酶均对辅酶NAD+有严格的依赖,在加入EDTA时酶活性受到很大的抑制,这验证了蛋白的锌离子和辅酶结合结构。其中库德毕赤酵母的木糖醇脱氢酶比活力最高为14.66U/mg,德尔布有孢圆酵母的木糖醇脱氢酶比活力最低为10.71 U/mg,且五种酶均在低温和低pH下能够较长时间保持较高的活性。不同来源的木糖醇脱氢酶其酶学性质存在比较明显的差异,德尔布有孢圆酵母的木糖醇脱氢酶在pH8.5和温度35℃时酶活性最好,Km值为20.96 mM,最大反应速率最高,Mg2+能够促进其活性,Ca2+对其有明显的抑制效果;季也蒙毕赤酵母的木糖醇脱氢酶在pH8.0和温度35℃时其活性最好,Km值为18.83 mM,在加入低浓度β-巯基乙醇时有较明显的促进作用;对木糖醇利用效率最好的是库德毕赤酵母的木糖醇脱氢酶,Km值为10.38 mM,在五种酶中亲和力最高,催化效果最佳(Kcat/Km,86.82mM-1min-1),在pH8.0和温度45℃条件下活性最佳,Mg2+能够明显的促进其酶活性,对其他木糖醇脱氢酶抑制明显的Ni2+对其基本没有影响,在Na+存在的条件下会对酶活性有很明显的促进作用,最高在300mM浓度时可达到171%,并且对于K+有高度的耐受性,该木糖醇脱氢酶能够高度耐受盐离子,但其在加入β-巯基乙醇时受到明显的活性抑制;树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶最适温度明显低于其他酶为35℃,不利于高温发酵使用,Km值为30.58 mM,亲和力最低;热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶最适温度为50℃,明显高于其他酶,适用于在高温发酵,Km值为19.27 mM,亲和力仅次于库德毕赤酵母,酶活性受Cu2+的抑制作用比其他木糖醇脱氢酶弱,Mg2+能够较大的促进其酶活性,在加入β-巯基乙醇时有少量的促进作用。本论文研究成功构建了三种可以代谢木糖醇的重组酵母菌株,并研究分析了其蛋白性质。本论文研究取得的成果使我们对酿酒酵母代谢木糖的相关机制有了更深入的认识,对不同木糖醇脱氢酶的蛋白性质研究为今后构建出能够高效发酵木糖的酿酒酵母及后续深入研究奠定基础,对实现木质纤维素燃料乙醇的高效生产具有重要的科学及实践意义。