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针对PD-1/PD-L1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂阻断相应信号通路解除免疫抑制,进而使T细胞增殖并活化,激活免疫系统发挥抗肿瘤作用。但其在NSCLC中的有效率不足20%,如何提高免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的疗效已成为当前研究的热点。Cetuximab是靶向表皮生长因子受体(EGFR)胞外区的高亲和力抗体,其结合靶蛋白后能阻断下游信号通路并杀伤肿瘤细胞。美国FDA已批准该抗体用于治疗复发性结肠癌及头颈肿瘤,但其在非小细胞肺癌(NSCLC)的临床研究中并未取得明显生存获益。目前,亟待设计具有更好抗肿瘤效果的新型抗体药物用于NSCLC治疗。多个研究发现肿瘤细胞EGFR基因突变能诱导升高其表面PD-L1分子的表达,PD-1/PD-L1抑制剂联合EGFR靶向药物能够更好的增强NSCLC中EGFR基因突变患者的抗肿瘤活性。另外,多项临床研究表明免疫检查点抑制剂联合血管生成因子(VEGF)抗体或者免疫检查点抑制剂PD-1抗体与CTLA-4抗体之间的联合用药能显著增强抗肿瘤效果。多特异性抗体由于特有的多特异性和多功能性,在恶性肿瘤和免疫治疗中展露曙光。多特异性抗体不是天然抗体,需经过人工制备,目前仍需研发更稳定有效的抗体结构使其能大量生产、制备从而应用于临床。本课题的研究目的:构建同时靶向EGFR、VEGF、PD-1、CTLA-4的crossmab结构多特异性抗体,并通过计算机辅助设计优化抗体结构,促进异源重链特异性结合,以期制备更稳定有效的NSCLC抗体治疗药物。本课题的研究方法:1.设计同时靶向EGFR、VEGF、PD-1、CTLA-4分子的多特异性抗体G6C225-9D95C4Crossmab,分别构建抗体中重链、轻链真核表达载体;2.通过哺乳动物表达体系人胚肾细胞-F克隆(293F)细胞表达多特异性抗体G6C225-9D95C4Crossmab,收集并纯化细胞上清后得到目的蛋白,进行SDS-PAGE后银染鉴定抗体蛋白;3.利用计算机辅助设计采用分子动力学模拟方法分析knobs-into-holes(KIH)结构中重链间的相互作用,改造相应位点氨基酸残基进而设计更有利于多特异性抗体重链二聚化的结构,并结合SDS-PAGE后银染实验进行验证。本课题的研究结果:1.基于knobs-into-holes(KIH)技术和crossover技术设计出多特异性抗体G6C225-9D95C4 Crossmab,并成功构建了 G6C225HV-knob/cmv、G6C225LV/cmv、9D95C4HV-CL-Fchole/cmv、9D95C4LV-CH1/cmv 四条真核表达载体;2.将构建出的四条真核表达载体瞬时共转入人胚肾细胞-F克隆(293F)细胞,得到目的蛋白,通过SDS-PAGE后银染进行初步鉴定;3.利用计算机辅助优化KIH结构,成功设计出稳定性及重链结合效率更高的多特性抗体结构lock-key。结论:本实验成功构建出能同时靶向EGFR、VEGF、PD-1、CTLA-4分子的多特异性抗体G6C225-9D95C4 Crossmab,并设计出更利于异源重链二聚化的lock-key结构,为后续大量制备纯度更高的稳定多特异性抗体奠定了基础。