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本试验通过分离非寄主植物可培养内生细菌,测定对桉树青枯病的防治作用,筛选对桉树青枯病有防治效果的非寄主植物的内生菌群,测定不同蒜品种的内生菌群对桉树青枯病的防治作用,并运用16S rDNA PCR-DGGE技术检测内生菌群在桉树体内的定殖情况,为桉树青枯病的防治研究开辟了一个新的方向,主要研究结果如下:1非寄主植物可培养内生细菌防治桉树青枯病研究本研究利用非寄主植物的可培养内生细菌防治桉树青枯病,采用平板涂布法从蒜、葱、洋葱和葡萄内分离内生细菌,采用抑菌圈法测定内生细菌对青枯菌的拮抗作用,分别在水培和土壤盆栽系统中测定其防治作用,同时检测有效非寄主植物可培养内生细菌的内生特性。结果表明:从蒜、葱、洋葱和葡萄内分离的14种可培养内生细菌中只有菌株SH、SB、PT、C1和C2对青枯病菌具有拮抗作用,其中PT效果最好,抑菌圈达到28 mm,拮抗作用依次为PT > C2 > C1> SH >SB。在内生细菌相互作用试验中,SH对C1具有拮抗作用,C2对SH有拮抗作用,分别涂有PT、SH的培养基能够促进SB的生长。青枯病菌对桉树具有较强的致病性,在水培条件下培养10天,桉苗的发病率已达到80%以上,试验中选用5×107 CFU/mL作为病菌的接种浓度。在水培系统中分别采用混合菌液法及根系沾菌法,菌株SH对桉树青枯病的防治效果最好,与对照相比发病率显著降低,尤其是采用根系沾菌法测定时,SH处理的桉苗发病率与对照相比降低了48%。土壤系统中采用浸根法,PT的防治效果最好,桉苗的发病率显著低于对照。SH具有一定的防治作用,但与对照相比未达到显著差异水平。菌株SH具有内生性,将桉苗浸于SH菌液中24 h,内生菌能进入到桉苗茎部,初步测定PT在桉树体内不具有内生特性。2非寄主植物内生菌群及根系分泌物防治桉树青枯病研究本研究利用非寄主植物内生菌群及根系分泌物防治桉树青枯病。选用青枯菌的非寄主植物蒜、葱、洋葱、桔、橙、柚,用来分离内生菌群,采用研磨离心的方法提取植物的内生菌群及提取液,并通过管碟法和平板涂布法测定其对青枯菌的抑制作用,然后测定蒜、葱、洋葱的研磨液、提取液和内生菌群对桉树青枯病的防治作用。选用玉米、小麦、绿豆及桉树无性系测定根系分泌物对桉树青枯病菌的影响。结果表明:植物的内生菌群与提取液分离时采用将组织研磨液900 rpm离心后再以12,000 rpm离心的方法,其中只有蒜、葱、洋葱的内生菌群稍有拮抗效果,其中蒜内生菌群的作用明显,与病菌混合培养后,采用平板涂布法测定的青枯菌数量明显减少。非寄主植物的提取液经过滤灭菌后,对青枯菌具有抑制作用,抑菌圈大小依次为蒜>洋葱>葱>橙,采用平板涂布法测定,青枯菌在研磨液中都未生长。防治结果表明蒜的研磨液、提取液和内生菌群对桉树青枯病均有防治作用,经蒜内生菌群20倍液处理10天后,桉苗的发病率降低了44%,显著低于对照。非寄主和寄主植物的根系分泌物对青枯病菌的生长都没有抑制作用,反而促进病菌的生长。尤其是玉米的根系分泌物,能够极大的促进青枯菌的生长。不同桉树无性系的根系分泌物对青枯菌的作用基本相同。3不同蒜品种内生菌群防治桉树青枯病研究本研究利用不同蒜品种的内生菌群防治桉树青枯病。选用的四个蒜品种分别为鲁优4号、鲁蒜王1号、双丰1号、四六瓣。采用研磨离心的方法分离内生菌及提取液,并采用管碟法和平板涂布法测定其对青枯病菌的抑制作用,分别在水培和土壤系统中进行不同蒜品种内生菌群对桉树青枯病的防治作用测定。拮抗作用测定中,鲁优4号、鲁蒜王1号和四六瓣对青枯病菌稍有抑制作用,双丰一号没有拮抗活性。病菌与蒜内生菌群混合培养后,与对照相比青枯菌的数量并未显著降低,数量级达到107 ~ 108个/mL。提取液具有很强的抑菌活性,作用依次为鲁优4号>四六瓣>鲁蒜王1号>双丰一号。防治结果表明不同蒜品种的内生菌群均有防治作用,其中四六瓣的作用最强,在水培系统中经其处理的桉苗从第6天开始发病率显著低于对照,到第10天时发病率与对照相比降低了36%;在土壤系统中到第15天的发病率与对照相比降低了32%,也达到了显著性差异水平。同时在水培系统中,经双丰1号处理桉苗的发病率在第8天时显著低于对照,经鲁蒜王1号处理桉苗的发病率在第10天时显著低于对照。在土壤系统中,经鲁优4号、鲁蒜王1号和双丰1号处理的桉苗发病率有不同程度的降低,但没有达到显著性差异。4 16S rDNA PCR-DGGE技术检测有效非寄主植物内生细菌在桉树体内的定殖本研究确定了尾叶桉组培苗适生的增殖培养基和生根培养基,并通过4次继代,培养出同一植株背景的尾叶桉苗用于试验。采用改良CTAB法提取植物内生细菌的DNA,利用垂直板电泳方法及不同变性剂浓度组合测定了蒜内生菌群的16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测体系,并将筛选出的检测体系应用于接种蒜内生菌的尾叶桉苗内生菌群的检测。尾叶桉苗接种外源内生菌群时,采用浸根处理使桉苗与外源内生菌群共培养的方法。筛选出16S rDNA PCR-DGGE检测技术体系即采用10%的聚丙烯酰胺凝胶浓度,35% ~ 75%的变性剂浓度,在1×TAE缓冲液中50V、60°C下电泳15 h。桉树和四个蒜品种均扩增出了230 bp的目的条带。不同背景的尾叶桉苗内生细菌的种类稍有不同,种群相似度为72%。不同蒜品种经DGGE电泳分离出较多的条带,表明蒜品种的内生细菌的多样性丰富,经DGGE聚类分析,不同蒜品种的内生细菌种类相似度为67%。共培养的方法能够使外源内生菌群进入尾叶桉体内,处理后桉树内生细菌的DNA条带增加。与蒜内生菌扩增条带位置相一致的,说明蒜内生菌能够进入到桉树体内;与蒜内生菌扩增条带位置并不吻合的原因可能是经过蒜内生菌的刺激,打破了桉树体原有内生菌群的平衡体系。尤其是经四六瓣处理的桉苗内扩增出5条与蒜中扩增位置一致的条带。