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创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是全球范围的重大公共卫生问题,死亡率和致残率极高。TBI后产生的原发性和继发性损伤会导致大量神经元变性和坏死,引起严重的神经功能障碍。TBI后的神经修复是临床上面临的严峻问题,最大程度地减少TBI后神经元的死亡和神经功能的丧失是目前研究的主要方向。干细胞移植可以有效保护受损的神经组织,为治疗TBI带来了新的希望。在动物模型实验中,TBI后通过静脉注射或脑内原位注射间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSC）可显著促进脑组织的再生和大鼠神经功能的恢复。骨髓源性间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC）免疫原性低,具有多向分化潜能,较胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESC）伦理争议少,是一种良好的种子细胞。然而,在治疗TBI时如何高效地将BMSC递送至脑病灶区仍然是一项技术挑战。因此,构建可以高效递送干细胞至靶区域的神经支架是干细胞治疗TBI的关键步骤。明胶是胶原蛋白的水解产物,在组织工程学应用中具有许多显著的优势,例如优异的生物相容性,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMP）介导的降解性,并且保留有天然细胞粘附基序（例如Arg–Gly–Asp（RGD））等。以葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,GOX）和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）催化制备的原位可注射水凝胶成胶速度快,催化特异性高,反应温和。因此,以双酶催化体系制备的可注射原位成型明胶水凝胶引起了广泛的关注。通过注射或喷雾的方法,可注射水凝胶可实现微创植入,封装细胞和/或生物活性分子以及准确填充不规则的组织缺损。此外,明胶水凝胶的三维多孔结构可以为细胞的附着和生长提供物理环境,便于包载细胞进行移植治疗。同时明胶水凝胶的物理化学性质,如含水量,溶胀行为和机械强度等也参与调节细胞的生物学功能。这些特性都表明双酶催化明胶水凝胶在脑组织工程应用中的潜力。目的本课题拟使用对羟基苯丙酸（Hydroxybenzene propanoic acid,HPA）修饰天然明胶获得GH高分子（Gelatin-hydroxyphenyl）。采用双酶催化（GOX/HRP）GH上的苯酚基发生共价交联制备可注射型GH水凝胶,并对其物理化学性质进行表征。然后通过调节GOX酶活力优化水凝胶性能,筛选出细胞三维培养效果和生物相容性最佳的GH水凝胶。随后通过原位立体移植包载BMSC的GH水凝胶治疗TBI大鼠,从动物模型和分子水平上系统的研究GH/BMSC神经支架对TBI大鼠神经修复的疗效和其潜在的机制。方法第一部分:GH水凝胶的制备及性能表征将H2O和DMF以体积比3:2混匀作为溶剂,通过EDC/NHS偶联体系合成GH高分子。通过核磁氢谱和紫外吸收光谱分别定性和定量地检测HPA的接枝效果;通过GOX/HRP（GOX=0.1,0.2,0.4 U/m L;HRP=0.5 U/m L）双酶催化体系制备的GH水凝胶,分别命名为GOX0.1UHRP0.5U,GOX0.2UHRP0.5U,GOX0.4UHRP0.5U水凝胶;倒置法测定水凝胶形成时间;冷冻干燥法测定水凝胶含水量;称重法检测GH水凝胶降解率;酶解法检测水凝胶生物降解性;扫描电子显微镜（SEM）表征水凝胶的微观结构;旋转流变仪测试水凝胶的机械性能。调节GOX活性（0.1～1 U/m L）制备不同交联度的GH水凝胶分别进行BMSC三维培养,并于1 d,3 d,7 d进行Calcein-AM/PI染色荧光拍照,检验细胞培养效果。使用微量过氧化氢（H2O2）检测试剂盒检测不同GOX活性（0.1,0.2,0.4 U/m L）制备的GH水凝胶在成胶24 h和48 h后产生H2O2的量;CCK-8检测GH水凝胶产生的H2O2对BMSC活性的影响;GH水凝胶注射到SD大鼠皮下,在3 d,7 d,14 d时对注射点周围组织取材进行HE染色观察炎症反应。第二部分:GH水凝胶包载BMSC移植对TBI大鼠神经修复作用的研究采用自由落体打击法建立大鼠中度TBI模型,造模完成后将大鼠随机分为Sham组、NS组、Scaffold组、BMSC组和Scaffold+BMSC组。模型建立7 d后,分别进行原位注射移植处理。移植治疗后第1 d,3 d,7 d,14 d,21 d,28 d通过改良神经功能缺陷评分（m NSS）评价TBI大鼠运动机能的恢复;移植治疗后23 d～28 d进行Morris水迷宫实验,评价TBI大鼠空间记忆能力和学习能力的恢复;治疗28 d后,处死大鼠进行取材,HE染色定量分析各组大鼠脑组织缺损体积;大鼠脑组织切片免疫荧光染色检测大鼠齿状回（Dentate gyrus,DG）的神经再生;提取脑损伤部位蛋白质及RNA,Western Blot检测神经营养（BDNF）,神经分化（Neu N,DCX,NSE）,凋亡（BAX）相关蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测神经营养和神经分化相关基因的表达。结果第一部分:GH水凝胶的制备及性能表征1、GH高分子的核磁氢谱和紫外吸收光谱均出现HPA中苯酚基的特征信号,而单独明胶的图谱未出现苯酚基的特征峰,表明GH高分子材料接枝成功,且HPA的接枝率为43.4μmol/g。2、GH水凝胶具有可注射性,有望精确地填充损伤部位;GH水凝胶内部为三维疏松网状结构;三组GH水凝胶的成胶时间为5～11 min,随着GOX活力提高成胶时间缩短;三组水凝胶的含水率均在90%以上;GH水凝胶酶解速率随着GOX活力提高而变缓,所有样品在体外PBS中均能够稳定存在14天以上;GH水凝胶弹性模量与GOX活力成正比,分别为162 Pa,1287 Pa,3650 Pa,三组之间差异显著（P<0.05）,其中GOX0.1UHRP0.5U水凝胶机械强度与脑组织相近。3、以不同活性GOX（0.1～1 U/m L）制备GH水凝胶进行BMSC三维培养,BMSC在GOX0.1UHRP0.5U和GOX0.2UHRP0.5U中具有较高的活性,并且在GOX为0.1 U/m L时BMSC在水凝胶内大面积伸展,表明GOX0.1UHRP0.5U水凝胶具有良好的细胞相容性。当GOX活力超过0.4 U/m L时水凝胶内的细胞活性较低,且在3 d后细胞大量死亡,并且水凝胶出现皱缩。4、GH水凝胶的H2O2释放量随着GOX活力的增加而上升,GOX0.1UHRP0.5U,GOX0.2UHRP0.5U,GOX0.4UHRP0.5U水凝胶48 h累积释放量分别为180,290,470μM。CCK-8实验结果显示500μM的H2O2会严重影响细胞活性。因此生物相容性良好的GOX0.1UHRP0.5U GH水凝胶可用于后续实验。5、大鼠皮下注射GOX0.1UHRP0.5U水凝胶在3 d,7 d,14 d均未观察到病理学变化,对注射点周围的组织进行HE染色分析未发现明显的炎症反应,表明GOX0.1UHRP0.5U水凝胶生物相容性良好。第二部分:GH水凝胶包载BMSC移植对TBI大鼠神经修复作用的研究1、成功建立了中度大鼠TBI模型;与NS组、Scaffold组相比,干细胞移植组（BMSC组,Scaffold+BMSC组）大鼠的m NSS评分在7 d后显著降低、23d～28 d的水迷宫实验穿越平台次数和目的象限停留时间显著增加（P<0.05）。这些结果表明BMSC组大鼠的运动能力,记忆认知功能得到显著改善、且Scaffold+BMSC组疗效更加显著。治疗28 d后,大鼠脑冠状切片HE染色结果表明Scaffold组、BMSC组和Scaffold+BMSC组移植治疗均能明显促进脑组织损伤体积的减小,且Scaffold+BMSC组效果更加显著（P<0.05）。治疗28 d后,脑冰冻切片免疫荧光结果显示BMSC组和Scaffold+BMSC组DG区有更高的NSE,Neu N,Ki67阳性表达,表明外源移植BMSC进行治疗促进了海马DG区神经元的存活与增殖。2、治疗28 d后,与其余各组相比,Scaffold+BMSC组脑损伤侧神经营养因子（BDNF）,神经标记物（NSE,DCX,Neu N）表达均显著升高（P<0.05）,凋亡相关蛋白BAX表达显著下调（P<0.05）。q RT-PCR结果显示与NS组相比,Scaffold+BMSC组神经营养因子相关基因（NGF,BNDF,NT3）表达均有上调,且NGF表达显著上调（P<0.05）;与NS组相比,Scaffold+BMSC组神经标记物（Neu N,β-III tubulin,MAP2）表达上调,其中MAP2表达极显著上调（P<0.001）。结论1、GH可注射水凝胶内部为三维多孔网络结构,稳定性良好,具有较高的含水率,可为细胞提供良好的生存微环境。成胶时间符合实际操作要求,机械强度接近脑组织。GOX0.1UHRP0.5U水凝胶具有更好的细胞相容性,包载BMSC进行三维培养可以促进细胞的粘附和增殖。GOX0.1UHRP0.5U水凝胶可被生物体降解,大鼠皮下移植不会引起炎症反应,生物相容性良好。2、GH水凝胶包载BMSC移植治疗TBI大鼠能够显著改善大鼠的运动及学习记忆功能恢复,促进损伤部位组织再生。其潜在的机制可能是GH水凝胶包载BMSC移植能够抑制神经元的凋亡,增加损伤部位神经营养因子的表达,促进内源性神经元的存活与分化。