多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是一种与自身免疫相关的中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病,其病因及发病机制尚未完全明了。补体在自身免疫性疾病中具有重要作用,而补体蛋白在多发性硬化中的表达仍存在争议。尽管近年来神经影像学技术的进步为MS临床诊断提供了有力的手段,但脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)检查在MS临床和研究方面的重要作用仍然是其他方法无法取代的。近年蛋白质组学技术的发展使我们对各种中枢神经系统疾病的脑脊液蛋白质组成有了更深入的认识,已有多种具有潜在诊断和治疗意义的生物学标记物陆续被发现,然而,脑脊液蛋白浓度仅为血清的百分之一且分布极不均匀：白蛋白约占蛋白总量的60%,免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)占7%。现有的蛋白质组学技术对样品上样量有一定限制,这就对低丰度蛋白的检测造成很大的干扰。本研究建立一种超滤和亲和层析相结合的方法,特异性去除脑脊液中的白蛋白和IgG,并在此基础上运用定量蛋白质组学技术对多发性硬化患者脑脊液进行研究,寻找特异性生物标记物和可能的致病机理,有助于对多发性硬化进行早期诊断和治疗。第一部分脑脊液高丰度蛋白去除技术研究目的：建立一种去除脑脊液高丰度蛋白的方法并进行双向电泳分析评价。方法：采用超滤法浓缩脑脊液样品至适当体积,用商业化血清白蛋白和IgG去除试剂盒处理,得到含低丰度蛋白的脑脊液,再用丙酮沉淀法除盐并进行二维凝胶电泳(2-DE)分析和2-DE Western blot鉴定。结果：此方法可有效去除脑脊液中的白蛋白和IgG,2-DE图谱分析显示,去除高丰度蛋白后脑脊液低丰度蛋白富集明显,通过与2-DE Western blot结果对比,发现四连接素的3个不同片段在去除高丰度蛋白后可全部显现。结论：本研究建立的脑脊液高丰度蛋白去除方法简单易行,有利于双向电泳中低丰度蛋白的检出。第二部分多发性硬化患者的脑脊液定量蛋白质组学研究目的：在本人建立的脑脊液高丰度蛋白去除方法的基础上,运用定量蛋白质组学技术对MS患者脑脊液进行比较蛋白质组学研究和生物信息网络分析,寻找特异性生物标记物和可能的致病机理。方法：收集急性期MS组与对照组脑脊液,将样品等量混合获得样品池,去除高丰度蛋白后冷丙酮沉淀提取蛋白,用双向荧光差异凝胶电泳(2-Dimensional Fluorescence Difference In-Gel Electrophoresis,2-D DIGE)技术分离蛋白,通过Typhoon9400多功能荧光扫描仪扫描获取数字图像,DeCyder 2D差异分析软件进行定量蛋白质组分析,筛选出表达有显著差异的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离／飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectroscopy,MALDI-TOF-MS)得到肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF),搜索SWISS PROT数据库得到差异蛋白,将差异蛋白输入MetaCore软件进行蛋白相互作用分析。对感兴趣的蛋白质采用Western blot进一步验证。结果：分别获得急性期MS患者及对照组脑脊液蛋白质组双向荧光差异凝胶电泳表达图谱,17个蛋白质点在两组凝胶图谱上存在显著差异(p<0.05),共鉴定出7种差异蛋白,蛋白相互作用分析结果显示大部分蛋白与补体系统激活有关。以补体C4b为例,进行2-D Western blot定性及Western blot半定量验证,其结果与2-D DIGE一致。结论：补体激活可能在多发性硬化的发病过程中具有重要作用,C4b及其他差异蛋白可作为急性多发性硬化的潜在生物学标记物候选蛋白。本研究为MS的发病机理、疾病诊断及药物靶点间的关系探索,提供了理论和实验依据。