子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,好发于围绝经期和绝经后妇女,流行病学调查显示肥胖、高血压、糖尿病、吸烟、恶性肿瘤家族史、不孕等均是子宫内膜癌发病的高危因素,绝经后及绝经过渡期阴道流血为子宫内膜癌最常见的症状。子宫内膜癌与宫颈癌、卵巢癌合称女性生殖道三大恶性肿瘤。其发病率在美国及一些欧洲国家已高居女性生殖系统恶性肿瘤首位,在我国,其发病率仅次于宫颈癌,高居女性生殖系统恶性肿瘤第二位,约占女性生殖道恶性肿瘤的20%.30%,且近年来其发病率逐年上升,患者呈年轻化趋势,其治疗仍无突破性进展,术后存活率仍较低,目前其病因及发病机制仍未明确。根据子宫内膜癌的临床和病理特征,Bohkman将子宫内膜癌分为Ⅰ型(雌激素依赖型)Ⅱ型(非雌激素依赖型),两型的高危因素不同。前者的发生与长期雌激素刺激(内源性或外源性)有关,多发生在子宫内膜增生症(包括单纯性增生、复杂性增生和不典型增生)的基础上,因无孕激素拮抗,内膜持续增厚继而发生癌变,主要的病理类型为子宫内膜样腺癌,ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)常呈阳性表达,这种病理类型占子宫内膜癌的大多数,肿瘤分化好,肌层浸润浅,预后较好,PTEN基因失活和微卫星不稳定是常见的分子事件；而目前研究发现,后者的癌变与雌激素刺激无明确联系,其发病早期内膜多萎缩,而非增生,主要的病理类型为浆液性乳头状腺癌和透明细胞癌,其ER、PR一般为不表达或低表达,多见于绝经后妇女,肿瘤恶性程度高,分化差,容易有深肌层浸润,预后不良。P53基因突变和HER2基因过度表达为常见的分子事件。为显著提高子宫内膜癌患者的生存质量和生存期,早期发现、早期诊断、及早干预是其关键,但是,目前为止,本病尚找到合适的早期诊断的特异性标志物。随着分子生物学及其技术和生物信息学的飞速发展,微小RNA(microRNA, mir-RNA)成为近几年来的研究热点,它是一类长约20-23 nt的非编码单链小RNA,具有高度保守性、时序表达特异性、组织表达特异性三大特性。通过在转录后结合到靶基因mRNA的3’-UTR(3’非编码区)诱导靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻译,或其他形式的调节机制,实现在转录后水平的调控作用,进而影响各种生物学性状。miRNA在肿瘤发生和发展过程中充当癌基因或者抑癌基因作用,其表达的变化与肿瘤的发生发展、诊断、治疗及预后密切相关。最近的研究报道显示发现miRNA表达谱的异常与子宫内膜癌的临床特征如分期、子宫肌层浸润、复发、淋巴转移等都存在明显相关性。如Yoneyama等人研究发现在子宫内膜腺癌中miR-200a、miR-200b、miR-429表达明显上调,可能通过下调抑癌基因PTEN(第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因)的表达导致子宫内膜癌的发生。Lee等研究发现当miR-200家族的表达被抑制后,HEC-1A细胞及Ishikawa细胞生长均减慢,而且转染了miR-429的HEC-1A细胞,细胞对顺铂的耐药性减弱。Karaayvaz等研究发现子宫内膜癌中miR-200c和miR-205表达明显升高,其中miR-205与子宫内膜癌的预后明显相关,通过Kaplan-Meier生存分析显示miR-205表达水平越高患者总体生存率的越低。结果提示miR-205通过降低PTEN的表达导致子宫内膜癌的发生发展及不良预后。miR-181a是近年来新发现的一种miRNA,广泛存在于各种细胞中,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡的过程发挥重要的调控作用。miR-181a的表达异常与机体免疫调节、白血病、乳腺癌、消化系统肿瘤、神经胶质细胞瘤、肺癌、口腔鳞状细胞癌和宫颈癌、卵巢癌的发生发展密切相关。目前,国外研究发现,在新鲜冰冻子宫内膜癌组织中,miR-181a的表达上调,其靶基因可能为PR, PR的表达与miR-181a的表达成负相关。而国内尚未见有关miR-181a与子宫内膜癌分型及临床特征关系的研究报道。本研究团队前期实验研究发现Hsa-miR-181a在甲醛固定石蜡包埋子宫内膜癌组织中表达上调,可能起到癌基因的作用,且Hsa-miR-181a在Ⅱ型内膜癌组织中的表达较Ⅰ型内膜癌组织明显上调。有大量研究者发现miRNA表达谱在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中存在差异,同时有不同的靶基因和分子信号通路,可能参与了Ⅰ型/Ⅱ型内膜癌的不同发病机制。如周静等选取了可能以ERa为靶基因的miR-100在细胞系Ishikawa(来源于Ⅰ型内膜癌)和KLE(来源于Ⅱ型内膜癌)体外培养细胞和体内成瘤组织以及10例临床内膜癌标本中进行了qRT-PCR验证,发现hsa-miR-100在Ⅱ型组的表达显著高于Ⅰ型组,其靶基因可能为ERa。Zhang等研究发现Ⅰ型子宫内膜癌中miR-143、miR-145明显下调,与DNMT3B(DNA甲基转移酶)过度表达相关,而在Ⅱ型子宫内膜癌中,miR-143、miR-145表达与DNMT3B并无明显相关性。那么miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型内膜癌不同发病机制中可能的靶基因或信号通路是什么?CA125是存在于细胞表面的一种大分子糖蛋白,广泛存在于体腔上皮起源的各种组织细胞中及这些组织细胞发生的肿瘤中,如在正常情况下子宫内膜、输卵管及腹膜都能有极其微量CA125生成,在卵巢上皮癌、输卵管癌、子宫内膜癌及间皮细胞癌等肿瘤中CA125均明显升高。现已被广泛应用于泌尿生殖系统、消化系统等肿瘤的诊断和追踪。目前在临床上,CA125已被广泛应用于盆腔包块(尤其是卵巢上皮性肿瘤)的鉴别诊断、监测疗效及判断预后。目前有关子宫内膜癌CA125的检测大多局限于血清学检测,然而子宫内膜癌与血清CA125与的关系研究及检测价值一直存在争议,有学者认为术前血清CA125与组织学类型、病理分期分级、肌层浸润及淋巴转移均明显相关,然而大部分学者认为血清CA125水平并不能准确地反映肿瘤进展程度,与肌层浸润深度无关,对预测预后无帮助。可能与子宫内膜癌患者的CA125抗原量不足、进入外周血后被迅速清除,或经宫腔内脱落未进入血液循环有关,致使早期子宫内膜癌血清CA125阳性率降低。有研究者发现将子宫内膜癌组织中CA125敏感性和特异性均显著高于血清CA125,且与子宫内膜癌病理分级有关,病理分期越高,组织中CA125表达率越高。本团队早期实验研究发现,CA125在子宫内膜及其病变组织中的表达与内膜组织的病理演变进程一致,病变越严重,腺细胞生长和分泌越活跃,产生的CA125越多,但是在低分化及恶性程度高的子宫内膜癌中CA125表达有减弱的现象。鉴于Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌在病理特征方面的差异,那么在Ⅱ型内膜癌中CA125的表达是否有减弱现象?Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中CA125的表达是否存在差异?有研究发现卵巢癌患者术前血清CA125与卵巢组织中miR-181a的存在关联性。相关性分析显示：卵巢癌患者术前血清CA125表达与miR-181a的表达成正相关,随着血清CA-125的增高的miR-181a的表达量逐渐升高。那么Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a与CA125的表达是否也存在相关性?若子宫内膜病变组织中miR-181a与CA125存在相关性,其可能的病理机制或信号通路是什么?对临床诊断或预后判断是否存在意义?为此,本实验拟通过检测甲醛固定石蜡包埋子宫内膜组织中miR-181a、CA125在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中的表达差异,分析miR-181a、CA125在不同类型子宫内膜癌中的表达差异及其两者的相关性,探讨miR-181a在子宫内膜发生癌变过程中的意义及其可能机制。第一章 Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中miR-181a的表达及其意义研究内容及方法：1、选择2011年1月.2013年12月,南方医科大学附属小榄医院收治的41例子宫内膜癌患者及中山大学附属中山医院收治的4例、南方医科附属南方医院收治的2例Ⅱ型子宫内膜癌患者。为了解子宫内膜癌变的发生发展过程,同时选取了南方医科大学附属小榄医院收治的子宫内膜增生症患者18例,正常子宫内膜患者13例。患者年龄24-69岁,平均48岁。术前均未行放化疗及内分泌治疗,术后诊断均经病理证实。2、子宫内膜癌组织均经免疫组织化学染色检测其中ER、PR表达：以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性信号,否则为阴性。根据组织切片染色结果分Ⅰ型子宫内膜癌(ER、PR均阳性)和Ⅱ型子宫内膜癌(ER、PR均阴性)。3、总RNA提取：每例石蜡标本连续切片10张,每张厚10μm,取组织细胞含量在50%以上区域的切片每例2-5张(平均4张)制备总RNA。将切片放入1.5mL无水乙醇洗涤2次去除残余二甲苯。彻底干燥后严格按照QIAGEN总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。4、紫外线分光光度计检测提取的总RNA的吸光度(OD值),采用1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。5、通过microRNA茎环引物进行逆转录,以U6为内参,采用SYBR green实时荧光定量PCR技术检测各组子宫内膜组织中miR-181a的表达。反应参数为95℃预变性6mmin；95℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸30s,共50个PCR循环。记录Ct值。miRNA相对表达量即ΔCt=Ct (miR-181a)-CtU6,计算ΔCt=(Ct(miR-181a)-CtU6)实验组-(Ct (miR-181a)-CtU6)对照纽,各实验组miR-181a相对对照组的表达倍数以Folds=2-ΔΔCt表示。结果：1、各组子宫内膜组织中miR-181a的表达：miR-181a在正常子宫内膜组织中可见表达,与正常子宫内膜组相比,miR-181a在子宫内膜癌组织、子宫内膜增生症组织中表达(△Ct值分别为.3.356±2.401、.1.893±2.568)分别上调11.228倍(P<0.05)、4.073倍(P<0.05)。且子宫内膜癌组织miR-181a的表达是子宫内膜增生症组的2.757倍(P<0.05)。2、Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织miR-181a的表达：与正常组相比,Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a的表达(ACt值分别为-2.957±2.453、.4.832±1.524)分别上调8.515倍(P<0.05)和31.233倍(P<0.05)；且Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a表达是Ⅰ型内膜癌组织的3.668倍(P<0.05)。与子宫内膜增生症组相比,miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型内膜癌组中的表达分别上调2.091倍(P>0.05,差异无统计学意义)、7.669倍(P<0.05)。结论：从正常子宫内膜,到子宫内膜增生症,再到子宫内膜癌,miR-181a的表达呈逐渐上调的趋势,miR-181a在子宫内膜癌变过程中能参与了子宫内膜癌形成的早期分子事件,起到了癌基因的作用,甚至有望成为子宫内膜癌的早期筛查及诊断标志物。然而在子宫内膜增生症组织中miR-181a的表达相对Ⅰ型子宫内膜癌差别无统计学意义,相对Ⅱ型子宫内膜癌组织则显著降低,Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a的表达明显高于Ⅰ型,miR-181a的这种差异表达可能在不同类型内膜癌的发生、发展过程中发挥重要作用,尤其与Ⅱ型子宫内膜癌的发病机制相关。第二章Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中CA125的表达及其与miR-181a的相关性研究内容及方法：将第一部分中子宫内膜组织标本均经过4%甲醛固定,常规作石蜡包埋切片,厚约4um,采用MaxVisionTM免疫组织化学染色法检测组织中CA125表达。实验步骤严格按MaxvisionTM检测试剂盒KIT-5001说明书操作。完全不染色：阴性(.)；CA125阳性染色：在细胞膜和(或)细胞质出现棕黄色颗粒。弱阳性(+)：染色呈浅棕色,且阳性细胞率小于10%(观察10个高倍视野)；中等阳性(++)：染色介于(+)与(+++)之间,阳性细胞率10%-50%；强阳性(+++)：CA125染色呈深棕黄色,结构清晰,阳性细胞率大于50%。结果：1、正常子宫内膜组织中的CA125的表达以弱阳性为主,子宫内膜增生症和子宫内膜癌组织中则以中等阳性及强阳性为主。子宫内膜癌中,Ⅰ型内膜癌中以强阳性表达为主,Ⅱ型内膜癌中以中等阳性为主。且不同类型子宫内膜癌组织中CA125表达差异有统计学意义(Z=一4.717,P<0.05)。2、子宫内膜癌变过程中miR-181a与CA125表达的相关性：在子宫内膜癌变过程中,miR-181a与CA125的表达呈负相关关系(P=0.026,r=.0.25)。结论：子宫内膜癌变过程中,CA125与miR-181a的表达呈负相关,这可能与低分化、恶性程度高的子宫内膜癌中CA125表达减弱的现象有关。全文结论：miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌间的表达差异可能与不同类型内膜癌的发生、发展相关。miR-181a可能参与了子宫内膜癌的发生发展,尤其是Ⅱ型内膜癌,起到了癌基因的作用。其机制可能是miR-181a通过调控CA125的表达而影响子宫内膜癌变,但具体作用机制尚需细胞水平实验的验证。