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目的:建立进展型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型,探索片仔癀(Pien Tze Huang,PZH)治疗进展型EAE小鼠的疗效以及研究片仔癀通过调控小胶质细胞的极化治疗进展型EAE小鼠的作用机制。方法:1.利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG35-55)多肽诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型,分别于发病点(S1)、发病初期(S2)、发病高峰期(S3)以及慢性持续期(S4)进行中枢神经系统(central nervous system,CNS)大脑、脑干以及脊髓的颈段、胸段和腰段部位的切片。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色检测炎症细胞的浸润情况,髓鞘染色法(luxol fast blue,LFB)检测髓鞘脱失情况。免疫组化检测M1型和M2型小胶质细胞浸润情况。2.造模成功后,分为空白组(Normal)、模型组(Model)、片仔癀发病给药组(Onset-PZH)、醋酸泼尼松发病给药组(Onset-PA)、片仔癀高峰给药组(Top-PZH)、醋酸泼尼松高峰给药组(Top-PA)。记录小鼠体重和神经功能评分,给药结束后HE染色检测腰髓中炎性细胞浸润情况,LFB染色观察腰髓髓鞘脱失情况,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中炎症因子γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)和白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)水平。3.造模后分设空白组、模型组、片仔癀给药组三组,给药结束后,流式细胞术检测M1型和M2型小胶质细胞的比例、免疫组化检测诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、精氨酸酶1(arginine-1,Arg-1)和2型髓系细胞触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM-2),Real-Time PCR检测M1小胶质细胞相关的iNOS、IFN-γ和TNF-α的mRNA水平和M2型小胶质细胞的Arg-1、TREM-3、IL-4和IL-10的mRNA水平,免疫荧光双染检测小胶质细胞内的p-STAT1、p-STAT3和p-STAT6蛋白水平。结果:1.小鼠经免疫后于Day 14开始相继发病,于Day 24到达发病高峰期,随后到达慢性持续期,症状稍微缓解并保持稳定。HE染色结果显示,EAE小鼠各部位均在发病点即开始有炎细胞浸润,并且随疾病的进展呈现持续增加的趋势。LFB结果显示,发病点即开始有髓鞘脱失,髓鞘脱失的程度随疾病的进展呈现增加的趋势。iNOS免疫组化结果显示,在发病点即开始有iNOS阳性信号,并随疾病的进展持续增加。Arg-1免疫组化结果显示,在发病点即开始Arg-1阳性信号,并随疾病的进展先呈现增加的趋势,于发病高峰期达到最高值,随后在慢性持续期阳性信号显著减少。2.临床评分结果显示,片仔癀发病起点给药和高峰给药均有效降低神经功能评分。组织病理学检测结果显示,经片仔癀治疗后,小鼠腰髓段组织炎细胞浸润减少,髓鞘脱失显著减轻。血清ELISA检测结果表明,相对于模型组,片仔癀给药后促炎因子IFN-γ、TNF-α的水平显著降低,抑炎因子IL-4、IL-10的水平显著升高。3.流式检测结果显示经片仔癀治疗后,进展型EAE小鼠CNS中的M1型小胶质细胞的比例显著降低,M2型小胶质细胞的比例显著升高。免疫组化结果显示,经片仔癀治疗后,EAE小鼠腰髓中的iNOS的表达显著降低,Arg-1和TREM-2的表达显著上升。Real-Time PCR检测结果表明,片仔癀治疗后iNOS、IFN-γ和TNF-α的转录水平显著降低,同时Arg-1、TREM-2、IL-4和IL-10的mRNA水平显著增加。免疫荧光双染结果表明,经片仔癀治疗后,进展型EAE小鼠小胶质细胞中p-STAT1蛋白水平和p-STAT3蛋白水平均显著降低,p-STAT6水平显著增加。结论:1.在进展型EAE的发展过程中,炎细胞浸润和髓鞘脱失程度逐渐加重,M1型小胶质细胞的浸润逐渐增多,M2型小胶质细胞的浸润则是先增加后减少。CNS不同部位中,腰髓段病理变化最严重。2.片仔癀发病起点给药和高峰给药均能减轻进展型EAE小鼠腰髓的炎细胞浸润,降低小鼠髓鞘脱失的程度,抑制血清中促炎因子IFN-γ和TNF-α的水平,提高抑炎因子IL-4和IL-10的水平,改善临床症状,从而能对进展型EAE起到治疗作用。3.片仔癀可抑制小胶质细胞的向M1型极化,促进向M2型极化,即片仔癀治疗进展型EAE小鼠可通过调控小胶质细胞向M2型极化来发挥作用。