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研究目的:巴戟天丸出自《古今医统大全》,由巴戟天、远志、茯苓、茯神、石菖蒲、地骨皮、人参组成。课题组前期研究表明,该方能够通过抗氧化损伤保护衰老大鼠的记忆功能,并具有抗骨质疏松的潜力。本研究基于以上发现,利用D-半乳糖致衰老模型大鼠观察巴戟天丸抗老年性骨质疏松作用。同时,采用D-半乳糖损伤成骨细胞模型,探索巴戟天丸水提物对成骨细胞的保护作用及机制。在此基础上,优化巴戟天丸的制剂工艺。目的是研究巴戟天丸对老年性骨质疏松的作用,初步探索其机制,并优化其制剂工艺,为巴戟天丸今后的开发利用奠定基础。研究方法:(1)对Wistar雄性大鼠皮下注射D-gal构建老年性骨质疏松模型,同时给予巴戟天丸水煎液(6g/kg/d,12g/kg/d)灌胃。16周后,检测骨形成相关指标和抗氧化相关指标;利用Western blot法与免疫组织化学染色法观察模型大鼠股骨骨保护素蛋白、RANKL/OPG、组织叉头框蛋白O1(Fox O1)和超氧化物歧化酶II(SOD2)蛋白表达;通过微计算机断层扫描技术(Micro-CT)分析股骨骨量与骨微结构。考察了巴戟天丸水提物对D-半乳糖致老年性骨丢失的药效作用及抗氧化能力的作用。(2)通过100 m M D-gal制备衰老成骨细胞模型,采用流式细胞术等手段探究巴戟天丸水煎液及其有效成分对衰老成骨细胞增殖、骨形成、抗氧化能力的影响;利用Western blot和免疫荧光检测了核因子-E2-相关因子(Nrf2)、蛋白激酶B(Akt)、血红素加氧酶-1(HO-1)、NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO1)蛋白表达。(3)以水晶兰苷和东莨菪内酯含量为指标,采用高效液相色谱法监测含量变化,优化巴戟天丸最佳制剂工艺。结果:(1)巴戟天丸水煎液(6g/kg/d,12g/kg/d)能够显著提高老年性骨质疏松的骨密度,改善相对骨体积、骨表面积/骨体积、骨小梁分离度、骨小梁数目、骨小梁厚度、结构模型指数等骨微结构指标;提高血清骨源碱性磷酸酶、骨钙素含量,上调股骨组织骨保护素蛋白的表达,降低RANKL/OPG的比值,发挥抗骨质疏松药效作用;与此同时,巴戟天丸水提物还能降低血清中的丙二醛含量,提高血清中过氧化氢酶和总超氧化物歧化酶活性,增加股骨Fox O1、SOD2蛋白的表达。(2)采用二次消化法提取成骨细胞。采用D-gal作用48 h构建D-gal损伤成骨细胞模型。以β半乳糖苷酶染色确证D-gal损伤后的成骨细胞出现细胞衰老特征。巴戟天丸水煎液(L,H)、水晶兰苷(10-2,10-1μM)、东莨菪内酯(10-2、10-1μM)、人参皂苷Rb1(10-4,10-3μM)、人参皂苷Rg1(10-1,1μM)、阿魏酸(10-4,10-3μM)及主要成分群(L,H)均可显著促进D-gal损伤成骨细胞的增殖,提高碱性磷酸酶活性。巴戟天丸水煎液(L,H)、水晶兰苷(10-1μM)、东莨菪内酯(10-1μM)、人参皂苷Rb1(10-3μM)及主要成分群(L,H)在给药浓度下能够显著降低D-gal模型成骨细胞的ROS水平,巴戟天丸水煎液(L,H)、水晶兰苷(10-1μM)及主要成分群(L,H)能够明显上调D-gal损伤成骨细胞的SOD活性;巴戟天丸水煎液(L,H),主要成分群(L,H)和阿魏酸(10-3μM)明显上调了D-gal损伤成骨细胞的CAT的活性。巴戟天丸水提物的作用效果与主要成分群的作用无显著差异,且均明显优于单个有效成分。巴戟天丸水提物和主要成分群能够通过上调Akt的磷酸化,激活Nrf2/Akt通路,促进Nrf2蛋白入核,增加下游抗氧化酶HO-1与NQO1表达,从而发挥抗氧化作用以防治骨丢失。(3)建立了稳定的以高效液相色谱法测定巴戟天丸中水晶兰苷与东莨菪内酯含量的方法;优选了巴戟天丸的制剂工艺,即以80目粉,添加药粉重40%的糊粉量,制成直径为6 mm的丸,此工艺条件下水晶兰苷与东莨菪内酯平均含量分别为0.348 mg/g,1.430 mg/g,RSD分别为0.524%,0.400%。结论:(1)巴戟天丸水提物能够有效降低老年性骨质疏松大鼠体内氧化应激水平,提高抗氧化酶活性,从而提升骨密度。(2)巴戟天丸水提物能够有效增强D-gal损伤成骨细胞的增殖活性和ALP活性,提高细胞内抗氧化酶活性,降低细胞内ROS水平。巴戟天丸效果与主要成分群基本相当,且其优于使用单个有效成分。巴戟天丸水提物的抗氧化、促骨形成的作用可能与激活成骨细胞的Nrf2/Akt通路有关。(3)形成了稳定性强,操作性可的巴戟天丸制剂工艺。