目的肝癌位居中国恶性肿瘤死亡率的第二位,是血供丰富的实体瘤,索拉菲尼等抗血管生成药物治疗存在耐药性、获益人群不明确等诸多问题,这主要由于肿瘤微环境和肿瘤血管形成的复杂性和异质性。课题组前期通过基因组学及裸鼠皮下成瘤实验发现PBLD体外体内抑制血管生成的初步证据,本研究围绕对肿瘤血管生成具有中枢性调控作用的VEGF-VEGFR2信号通路,整体考虑肿瘤细胞及所处的微环境,探索抑癌基因PBLD抑制肝癌血管生成的分子调控网络,从而为新的抗肿瘤血管生成策略提供科学依据和理论基础。方法1.PBLD对肝癌血管生成的影响1)TCGA、GEO数据库及临床样本中验证PBLD在肝癌组织中的表达情况及其与血管生成基因的表达相关性。2)体外细胞功能实验检测肝癌细胞中PBLD的表达变化对血管内皮细胞增殖、迁移及管样结构形成能力的影响。2.PBLD通过DUSP6-ERK-HIF-1a-VEGF轴抑制肝癌的血管生成的机制验证1)功能实验明确PBLD对缺氧状态下肝癌血管生成的抑制作用,肝癌细胞系及肝癌临床样本验证PBLD对HIF-1a-VEGF信号轴基因表达的影响。2)蛋白免疫印迹、通路恢复实验明确ERK的磷酸化对PBLD介导的HIF-1a/VEGF轴抑制作用的影响。3)恢复实验验证PBLD通过DUSP6调控ERK磷酸化。4)蛋白稳定性实验、蛋白免疫共沉淀、泛素化水平检测及泛素化位点突变实验明确PBLD调控DUSP6表达的具体分子机制。3.PBLD通过外泌体-miR-940-ETS1-VEGFR2轴抑制肝癌血管生成的机制验证1)透射电子显微镜及外泌体表面特异性标记物对提取肝癌细胞外泌体进行鉴定,荧光染色技术检测血管内皮细胞对肝癌细胞来源外泌体的摄取。2)MicroRNA芯片、细胞及肝癌组织qRT-PCR、蛋白免疫印迹及体外功能实验明确肝癌外泌体及其中的miR-940对内皮细胞血管形成及VEGFR2表达的影响。3)qRT-PCR、蛋白免疫印迹、双荧光素酶报告基因及恢复实验明确miR-940的靶基因。4)外泌体-miR-940-ETS1轴调控血管生成的体内体外恢复实验。5)qRT-PCR、蛋白免疫共沉淀以及染色质免疫共沉淀实验明确PBLD调控miR-940表达的分子机制。结果1.临床样本及公共数据库数据分析提示PBLD在肝癌组织中的表达显著下调,与肝癌的转移及预后相关,且PBLD与血管内皮标志物CD31及血管生成基因表达呈现负相关。2.体外功能实验证实PBLD过表达肝癌细胞培养上清抑制血管内皮细胞增殖、迁移及形成管样结构的能力。3.PBLD通过降低ERK磷酸化从而抑制HIF-1a-VEGF轴的表达,最终下调肝癌细胞VEGF的表达和分泌。4.PBLD通过抑制DUSP6泛素化蛋白酶体降解途径维持其稳定性,从而下调ERK的磷酸化水平。5.PBLD过表达肝癌细胞通过外泌体中的miR-940靶向内皮细胞中ETS1-VEGFR2轴从而抑制血管生成。6.PBLD在肝癌细胞内通过与TCF4结合,促进其对miR-940的转录激活作用。结论本研究证实PBLD负向调控肝癌血管生成,过表达PBLD一方面通过DUSP6-ERK/MAPK-HIF-1a轴抑制肝癌细胞内VEGF的表达和分泌,另一方面通过外泌体向内皮细胞传递miR-940,靶向内皮细胞中的ETS1-VEGFR2轴下调内皮细胞中VEGF的主要受体VEGFR2的表达,从而协同抑制肝癌血管生成。