鹅圆环病毒(goose circovirus, GoCV)是近年来发现的圆环病毒科的一个新成员。由于它通常侵染淋巴细胞等增殖速度快的细胞,引起免疫力下降,导致动物容易继发感染其他病原,从而给养禽业造成不可忽视的经济损失。2005年,我们实验室从永康禽流感病死鹅中检测到了GoCV,并构建了含有GoCV1813 bp近全长基因组的pMDT-GoCV-yk01质粒。以该质粒DNA为模板,应用设计带BamH I酶切标记位点的引物,PCR扩增获得GoCV 1821 bp带标记的全长基因组DNA,克隆到pGEM-T Easy载体上,经酶切鉴定得到阳性重组质粒pGEMT-GoCV-Bam。BamHⅠ酶切该重组质粒,割胶回收1.8 kb的GoCV全长基因组DNA片段,自连后再与接头连接,以接头为引物PCR扩增,并经割胶回收获得双拷贝GoCV全长基因组的3.6 kb DNA片段,克隆于pGEM-T Easy,经酶切鉴定,筛选到含GoCV全长基因组正向串联二聚体的克隆pGEMT-2GoCV。EcoR I酶切pGEMT-2GoCV质粒并进行纯化与浓缩,获得感染性克隆DNA样品。脂质体包裹处理好的感染性克隆DNA,分别经尿囊腔和胚体接种GoCV阴性的鹅胚、经腹腔和静脉接种雏鹅,经常规PCR方法检测到GoCV在体内的增殖。将已发表的24株鹅圆环病毒全长基因组序列进行联配,找出其保守序列区域,利用软件Primer Premier 5.0重新设计合成3对引物,用常规PCR方法筛选出其中的一对。以构建的pMDT-GoCV-yk01,质粒为标准模板,经退火温度、循环次数等反应条件优化,建立了GoCV荧光定量PCR的标准曲线,经溶解曲线分析确定了扩增产物的特异性。试验结果表明,建立的GoCV实时荧光定量PCR方法检测范围广,Ct值范围为12～32,最低检出拷贝数为1.46×102。应用建立的方法对常规PCR检测为阳性的转染样品进行了定量,结果阳性法氏囊样品中GoCV DNA含量为1.57x106拷贝/mg,6个阳性血清中的含量为4.96×104～5.92x 105拷贝/μL。