酯酶比色传感阵列的构建及茶叶农药残留检测研究

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茶叶在生长过程中容易受到茶蚜虫(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)和茶小绿叶蝉(Empoasca pirisuga Matumura)等数十种病虫害的侵袭,农药的使用在其病虫害防治、稳产和增收等方面具有重要作用。然而,茶叶生产中的农药不当使用和滥用等不但危害消费者健康,诱发环境污染及引发生态安全风险,也对茶叶消费市场和茶叶进出口贸易产生重大影响。因此建立快速、简便和适于现场化的农药残留检测方法具有重要意义。基于酶抑制原理的农药残留快速检测技术适于现场化检测及筛查,但其只能实现定性或半定量检测。色谱、质谱和毛细管电泳等检测方法具有检测精度高、灵敏度好以及检测限低等优势,但也存在使用成本高、操作繁琐和设备便携性差等不足。免疫学检测手段灵敏度高,装置易于微型化,但使用的抗体成本高且检测对象单一。传感器法可基于光学和电化学等多种检测手段实现物质检测,其中基于光化学比色检测技术的比色传感器具有操作简便、响应快速、信息量大和检测成本低等优势,近年来在农药的检测研究中发展较快。光化学比色传感器以反应体系的颜色变化作为反应程度的度量因子,借助强大的计算机颜色管理系统和数字图像处理技术的图像比色分析已在物质的定性和定量检测中显示出独特优势。本研究以制备的植物酯酶和商品化的乙酰胆碱酯酶为特异性敏感材料,以图像比色分析为检测手段,设计、构建了两种酯酶比色传感阵列,并基于计算机数字图像处理技术和模式识别算法实现了茶叶中的农药残留检测,以期为农药的快速检测提供思路和参考。本论文主要工作如下:1)植物酯酶的制备及其对农药的敏感性研究首先通过筛选实验发现重庆二八豇植物酯酶具有较高活性和比活力,或可作为农药检测的备用酶,然后初步优化了该酶的提取工艺和酶促反应条件;通过盐析、离子交换层析和分子筛纯化了植物酯酶;研究发现该植物酯酶活性基本不受常见金属离子和茶叶部分组分的影响,且该酶的稳定性优于商品化的乙酰胆碱酯酶;该植物酯酶对10种有机磷和氨基甲酸酯类农药较为敏感,可作为这两类农药检测用酶及后续构建比色传感阵列的特异性敏感材料;通过分子对接初步研究了植物酯酶对两类不同农药敏感性差异的可能机制。2)酯酶比色传感阵列系统的设计及构建分析了基于图像比色分析实现混合体系中特定组分检测的方法,并在此基础之上,设计及构建了以乙酰胆碱酯酶为特异性敏感材料的单酯酶比色阵列系统和以植物酯酶和乙酰胆碱酯酶为特异性敏感材料的双酯酶比色阵列系统,前者是基于单反应显色体系的颜色强度变化实现图像比色分析,后者是由6种特异显色反应组成具有交叉响应机制的比色传感阵列,其可通过阵列差谱实现图像比色分析;分别建立了两种酯酶比色阵列的工作流程及后续图像采集、图像预处理、图像特征值提取等方法。3)基于单酯酶比色传感阵列结合模式识别算法的茶叶中农药定量检测含不同浓度农药的阵列显色体系存在肉眼可见的颜色差异,以此为基础通过图像处理技术建立了农药标样浓度与CMYK色彩空间颜色强度的对应关系;构建了基于Levenberg-Marquardt算法的反向传播神经网络(Levenberg-Marquardt backpropagation neural network,LMBP)定量分析模型,基于该阵列和构建的LMBP模型实现了农药样品检测;基于单酯酶比色阵列对含不同有机磷和氨基甲酸酯类农药的茶叶脱色提取液分别作图像比色分析,结果显示,以LMBP模型作定量检测所得结果与气相色谱(gas chromatography,GC)无显著性差异(P>0.05);准确性、精密度和重现性实验结果显示该方法具有良好的稳定性,可为实际样品中农药的快速检测提供参考。4)基于双酯酶比色传感阵列结合模式识别算法的茶叶中农药定性和半定量检测不同种类农药的阵列差谱以及同种农药不同浓度的阵列差谱均存在肉眼可见的颜色差异,以特征差谱为基础,通过图像比色分析结合模式识别算法实现了不同种类农药样品及同一种农药不同浓度样品的定性检测;含农药的3种茶叶脱色提取液与对应的农药标准样品的差谱颜色无显著性差异(P>0.05),且通过欧氏距离可被聚为一类;基于农药浓度及其对应的特征阵列差谱,通过参数优化构建了遗传算法优化的反向传播神经网络(genetic algorithm-backpropagation neural network,GA-BP)和遗传算法优化的支持向量机(genetic algorithm-support vector machine,GA-SVM)的农药检测自动分类器,结果显示,GA-BP和GA-SVM分类器具有良好的稳健性和泛化能力,可实现茶叶中农药的定性及半定量检测。5)基于双酯酶比色传感阵列结合模式识别算法的茶叶中农药定量检测基于双酯酶比色传感阵列和图像处理技术探索了农药标样浓度与阵列差谱欧氏距离的对应关系,并以此为基础分别建立了3种农药定量分析模型,对比结果显示,通过参数优化的广义回归神经网络(generalized regression neural network,GRNN)定量模型的预测性能优于LMBP模型和线性回归模型,且基于GRNN模型所得农药浓度值与实际值的皮尔逊相关系数达0.9954;基于双酯酶比色阵列和GRNN定量模型分析含有机磷和氨基甲酸酯类农药的茶叶脱色提取液所得结果与GC检测结果间无显著性差异(P>0.05);基于双酯酶比色阵列和模式识别算法建立的图像比色分析法具有较高的准确度、精密度和较好的重现性,可为农药的快速检测提供参考。
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