【摘 要】
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聚3-羟基丁酸酯（Poly 3-hydroxybutyrate,PHB）是一类可以由微生物全合成的高分子聚酯,具有与石油基塑料相似的物理性质和热加工性能以及生物可降解性。PHB可以生物质资源进行发酵生产,但其昂贵的生产成本是产业化大规模生产PHB的最大障碍。PHB生产大多以淀粉和糖类物质作为原料,其成本占总生产成本的30%-40%以上,因此降低PHB的原料成本十分重要。木质纤维素具有来源广泛、价格
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聚3-羟基丁酸酯（Poly 3-hydroxybutyrate,PHB）是一类可以由微生物全合成的高分子聚酯,具有与石油基塑料相似的物理性质和热加工性能以及生物可降解性。PHB可以生物质资源进行发酵生产,但其昂贵的生产成本是产业化大规模生产PHB的最大障碍。PHB生产大多以淀粉和糖类物质作为原料,其成本占总生产成本的30%-40%以上,因此降低PHB的原料成本十分重要。木质纤维素具有来源广泛、价格低廉和可再生的优势,并且不存在“与人争粮”的问题,是未来工业化生产PHB的最具应用潜力的原料。前期工作以高抗逆性Corynebacterium glutamicum S9114为出发菌株,将PHB合成相关基因和木糖代谢、转运相关基因整合到基因组上,获得了一株能够利用葡萄糖和木糖稳定合成PHB的C.glutamicum JH02菌株。本论文的研究目的是在C.glutamicum JH02基础上通过分子生物学改造和探究谷氨酸棒状杆菌合成PHB的最适NH4+添加量进一步提高重组谷氨酸棒状杆菌合成PHB的能力,并且将获得的重组菌株在麦秆水解液中检验其生产PHB的能力。具体研究内容包括:（1）细胞形态工程改造增大细胞体积,从而提供PHB在胞内积累的潜力;（2）膜定位表达PHA合酶,提高PHA合酶的稳定性以及缩短PHA合酶参与聚合反应的空间距离;（3）引入phaP基因,缩小PHB颗粒的粒径起到保护菌体的作用;（4）增加乙酰辅酶A流入PHB合成路径的代谢通量;（5）探究氨氮水平（NH4+）对C.glutamicum合成PHB的影响;（6）适应性进化提高C.glutamicum对木质纤维素中木糖的利用能力。第一部分是通过分子生物学改造来提高C.glutamicum JH02合成PHB的能力。为了增大细胞体积,为PHB的积累提供更多的空间,通过过表达细胞形态相关的pknB和WhcD基因分别使细胞干重增加了 1.0倍和1.1倍,促进了谷氨酸棒状杆菌细胞生长,最终PHB的产量分别提高了 177.0%和163.0%。为了提高PHA合酶的稳定性,缩短PHA合酶参与聚合反应的空间距离,将PHA合酶定位在细胞膜上,获得的两株重组菌株JH02-Peftu-（Ncgl）phaC 和 JH02-Peftu-（porB）phaC使胞内 PHB 含量显著提高 70.1%,140.6%,使细胞干重增加1倍左右,最终两株重组菌的PHB产量分别提高195.0%和310.6%。第二部分是探究了氨氮对C.glutamicum合成PHB的影响。通过浓度梯度实验确定当NH4+添加浓度为45 g/L时,C.glutamicum JH02获得最高的PHB产量。RT-qPCR实验表明当添加合适的NH4+浓度时,EMP途径、TCA循环和PHB合成路径的相关基因转录水平都明显上调,这证明氨氮的添加不仅能促进细胞生长,更重要的是能有效促进PHB合成相关基因的表达,从而促进胞内PHB的积累。第三部分是检验重组菌株在麦秆水解液中合成PHB的能力,以及通过适应性进化提高C.glutamicum对木质纤维素中木糖的利用速率。通过膜定位表达PHA合酶获得的重组菌株JH02-Peftu-（Ncgl）phaC在30%固含量里的麦杆水解液中经过补料批发酵,最终获得了 16.2 g/L的PHB产量。C.glutamicum木糖利用能力的适应性进化实验表明,对于非天然的PHB生产菌株,适应性进化不利于胞内合成PHB。本论文获得的重组菌株C.glutamicum JH02-Peftu-（Ncgl）phaC在合适的NH4+浓度下利用木质纤维素合成PHB的能力显著提升,胞内PHB含量最高可以达到39.3 wt%,PHB产量最高可以达到16.2 g/L,与对照菌株C.glutamicum JH02相比,胞内PHB含量提高了 134.8%,PHB产量提高了 57.3%。本论文获得的工程菌株实现了利用真实木质纤维素体系生产PHB的最高指标,为接下来木质纤维素生产PHB的工业化应用提供了一株有潜力的候选菌株。
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