1.背景　　镉（Cd）是一种重金属毒物，广泛应用于工业生产，常通过环境和职业暴露对人体产生严重危害。镉具有较长的生物半减期，对多器官、多系统产生毒作用，主要表现为肾损伤、肝损伤、呼吸系统疾病、神经系统障碍、骨骼系统损害等，已有实验研究和流行病学调查数据表明镉及其化合物可导致多种癌症的发生。国际癌症研究组织（IARC）于1993年已将镉及其化合物确认为人类第一类致癌物。研究表明，镉及其化合物的致癌机制十分复杂，涉及到遗传学机制和表观遗传机制，但明确具体的分子致癌机制至今未阐明。近年来，随着人类基因组计划的完成和分子生物学技术的迅猛发展，越来越多研究表明，过去被认为是基因组转录“垃圾”的长链非编码RNA（LncRNA)可以在转录前、转录后和表观遗传等多个水平参与靶基因的调控而发挥重要的生物学功能，LncRNA正逐渐成为研究热点。转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）是研究的较早的LncRNA，最初是在非小细胞肺癌的研究中被发现和命名旳，被证实与肺腺癌的转移和患者预后密切相关。随后研究发现，MALATl在肝癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌及结肠癌等多种肿瘤中均呈高表达，具有促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等细胞生物学行为。而MALATl在镉毒作用过程中是否发挥作用还不清楚。本研究拟在细胞、动物和人群水平探讨MALATl作为镉毒作用新分子标志物的可能性，同时开展相关机制及调控功能研究。研究将对于镉暴露人群生物监测和高危人群筛选均有重要现实意义和应用前景，也为镉毒性反应的早期检测和机制研究提供了新的思路。　　2.目的　　2.1从前期完成的镉恶性转化16HBE细胞lncRNA、miRNA和mRNA表达谱中筛选出差异表达的lncRNA-MALATl，运用生物信息学方法构建MALATl与lncRNA、miRNA和mRNA的共表达调控网络图，筛选其靶基因。　　2.2在氯化镉恶性转化16HBE细胞不同阶段中验证MALATl的差异表达；采用RNA干扰技术研究沉默MALATl后对细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力等体外生物学行为及6个生物学行为相关因子mRNA表达的影响。　　2.3利用前期创建的亚慢性镉染毒动物模型，分析模型组织（肺、肾、肝）中MALATl及6个生物学行为相关因子mRNA的表达规律，探讨MALATl在模型组织中的调控作用。　　2.4对镉职业暴露人群进行职业健康调查后，检测接触镉作业工人血液MALATl的表达情况,分析其与体内镉（血镉、尿镉）含量和肾损害指标β2-微球蛋白的关系，进一步探讨MALATl作为镉毒性作用新分子标志物的可能性。　　3.方法　　3.1生物信息学分析方法:在前期完成的16HBE细胞芯片表达谱结果的基础上，用生物信息学方法分析MALAT1的生物学特性。①差异表达的MALAT1重注释（在基因组上对MALAT1进行重定位，确定其在染色体上的位置及与其他基因的关系）、②MALAT1靶基因预测(包括cis靶基因预测、trans靶基因预测和MALAT1在蛋白水平的靶基因预测)、③靶基因gene ontology分析（将靶基因mRNA数据向gene ontology数据库各节点映射，进行GO分类，分析差异表达的mRNA的功能属性；计算每个节点的基因数目，通过P值来表达得到的GO功能途径的显著程度，设阀值为P<0.05，P值越小，GO功能途径越显著）、④靶基因pathway分析（向KEGG pathway数据库映射，通过P值来表达得到的生物学途径的显著程度，设阀值为P<0.05，据此统计基因在每个pathway中的富集程度）、⑤绘制MALAT与靶基因调控网络图,进一步筛选靶基因。　　3.2 qPCR技术检测MALAT1与6个相关基因的表达:采用qPCR技术检测本课题组前期建立的氯化镉恶性转化模型细胞系不同阶段细胞MALAT1和6个细胞生物学行为相关因子FOXC2、BCL-2、BAX、STAT3、TGF-β1和EGFR的表达水平。　　3.3 RNA干预技术沉默MALAT1表达后检测生物学功能:设计并合成符合条件的siMALAT1序列，构建质粒，对3组氯化镉恶性转化模型细胞系细胞（正常16HBE细胞、15th和35th代镉恶性转化16HBE细胞）进行基因转染，使MALAT1在细胞中表达沉默。转染48和/或72h后收集细胞。用qPCR技术检测6种生物学行为相关因子的表达情况。采用各种体外细胞试验方法检测转染siMALAT1对模型细胞的细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和转移等生物学行为的影响：用MTT法检测和评价转染siMALAT1对细胞增殖的影响、流式细胞术法检测和评价其对细胞周期和细胞凋亡的影响、transwell侵袭/转移试验检测评价其对细胞侵袭/迁移能力的影响。　　3.4利用前期创建的亚慢性镉染毒大鼠模型研究MALAT1的表达及其功能:采用qPCR技术检测亚慢性镉染毒模型大鼠（SPF级别SD大鼠4组，每组8只：对照组（0.9％NaCl），CdCl2染毒低剂量组0.306mg/kg，中剂量组0.612mg/kg和高剂量组1.225mg/kg；腹腔注射CdCl2，每周5次，连续染毒14周）肺、肝和肾脏组织中MALAT1和6个细胞生物学行为相关因子的表达情况。用无焰原子吸收分光光度法对大鼠组织（肺、肝和肾脏）中镉含量进行测定。并对各组织中MALAT1表达量与镉含量，及其与6个细胞生物学行为相关因子分别作统计学相关分析，了解MALAT1在大鼠中的功能。　　3.5检测镉职业暴露人群MALAT1的表达及其功能研究:qPCR技术检测深圳市某镍镉电池厂54名镉职业暴露工人血液中MALAT1的表达情况。原子分光光度法测定工人的血和尿中镉的含量，ELISA法测定肾功能损害指标β2-微球蛋白含量，并与MALAT1的表达水平进行统计学相关分析，初步了解MALAT1作为镉暴露人群分子标记物的可行性。　　3.6统计学方法:采用SPSS13.0软件处理系统对结果进行统计学分析。MALAT1等基因mRNA的相对含量以mean±SD表示。两组间均数比较用t检验，三组及以上组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法或Dunnett T3法；及采用Pearson法进行相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。　　4.结果　　4.1生物信息学分析结果:通过GO功能分类注释得出，差异表达的MALAT1在细胞组成方面，在细胞核、细胞器、细胞质、膜胞器等方面都起到功能；在分子功能方面，参与核苷酸结合物、蛋白结合物、分子粘合物、激酶活性和转移酶活性等功能；在生物学过程中，参与初级代谢过程、新陈代谢过程、细胞周期过程、细胞代谢过程、生物学周期过程等过程。通过Pathway分析得知MALAT1在细胞周期、前列腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、膀胱癌、胰腺癌等方面的功能有显著地变化。共表达网络图得出，MALAT1与TP53、MSH2、ATR和DDB2等因子存在共表达关系。　　4.2细胞基因表达qPCR检测结果:荧光定量PCR（qPCR）检测结果显示，MALAT在正常16HBE细胞（未染镉）、氯化镉转化16HBE细胞初期（6th代）、中期（15th代）及恶性转化期（35th代）的表达水平逐渐升高，染镉组各阶段细胞内MALAT1的平均表达量分别是对照（未染镉）组细胞的1.1倍，1.8倍和2.3倍。结果表明，MALAT1在镉转化16HBE细胞中存在上调表达，且与恶性转化程度密切相关。　　4.3镉毒性作用中MALAT1对细胞增殖的调控作用:转染siMALAT172h后，正常16HBE细胞、15th代和35th代转化16HBE细胞的增殖能力都受到不同程度抑制，生长抑制率显著提高，分别是转染24h时的12.5倍、34.9倍和2.9倍。15th代和35th代转化16HBE细胞的生长抑制率分别是正常16HBE细胞的1.39倍和1.40倍，差异有统计学意义。表明siMALAT1与细胞生长抑制相关。进一步检测细胞增殖相关基因STAT3和TGF-β1表达情况，与MALAT1沉默前相比，正常16HBE细胞、15th代和35th代转化16HBE细胞中STAT3的表达水平均降低，分别降低了58.1%，60.8%和65.7%；TGF-β1的表达水平也降低，分别降低了23.6%，82.3%和83.6%；表明siMALAT1可能参与STAT3和TGF-β1的表达调控，MALAT1对镉毒性中的细胞增殖能力有调控作用。　　4.4镉毒性作用中MALAT1对细胞周期的调控作用:转染siMALAT1后，正常16HBE细胞、15th代和35th代转化16HBE细胞的G1期细胞百分比较沉默前显著提高，分别提高18.7%，10.5%和15.0%。表现为siMALAT1可致模型细胞周期G1/G0期阻滞，抑制细胞周期进程。　　4.5镉毒性作用中MALAT1对细胞凋亡的调控作用:转染siMALAT1后，正常16HBE细胞、15th代和35th代转化16HBE细胞总凋亡率均较干扰前降低，分别下降36.6%，69.4%和35.2%；凋亡相关因子BAX的表达下调，分别降低63.2%，58.0%和76.4%；而BCL-2则呈上调表达，分别较沉默前提高1.3倍、1.4倍和0.6倍；表明siMALAT1可能参与BAX和BCL-2的表达调控，与细胞凋亡密切相关。　　4.6镉毒性作用中MALAT1对细胞迁移和侵袭的调控作用:转染siMALAT1后，正常16HBE细胞、15th代和35th代转化16HBE细胞的迁移能力降低，转移过膜细胞数较沉默前分别减少21.1%、3.3%和62.4%；同时降低了细胞侵袭能力，侵袭过膜细胞数较沉默前分别下降66.7%、57.1%和70.8%。进一步检测迁移/侵袭相关因子FOXC2和EGFR的表达情况，结果显示，转染siMALAT1后三组细胞FOXC2呈下调表达，较沉默前分别降低25.8%、86.8%和94.6%；EGFR也呈下调表达，分别降低64.1%、69.5%和90.0%；表明si MALAT1可能参与FOXC2和EGFR的表达调控，影响细胞迁移和侵袭能力。　　4.7大鼠模型组织中MALAT1的表达规律及其相关性:在亚慢性镉染毒大鼠模型肺、肝、肾各组织中MALAT1均呈上调表达，高剂量组分别是对照组的8.4倍、2.5倍和2.5倍。6个生物学行为相关因子（FOXC2、BAX、STAT3、EGFR和TGF-β1）的表达水平明显改变，其中FOXC2和TGF-β1在三个组织中均呈显著上调表达，且表现为剂量反应关系。大鼠各组织（肺、肝和肾）镉蓄积量均显著增高，高剂量组分别达到2.73μg/g、123.96μg/g和128μg/g，有剂量反应关系。统计学相关分析显示，肺脏组织MALAT1表达量分别与镉含量、STAT3、BAX和TGF-β1表达量呈正相关关系，与BCL-2呈负相关关系。肾脏组织MALAT1表达量与EGFR表达量呈正相关关系。　　4.8镉职业暴露人群血液MALAT1表达规律及其相关性:qPCR结果显示，54名镉作业工人血液中MALAT1呈上调表达，并随体内镉（尿镉）含量的增加而升高，具有剂量依赖关系。职业健康检测结果显示，工人血镉含量均在参考值范围内，未见超标者；尿镉/肌酐含量超标者3人，占总受检人数的5.56%，β2-微球蛋白/肌酐含量超标者2人，占总受检人数的3.77%。统计学相关分析结果显示，血液MALAT1表达量分别与血镉含量，尿镉/肌酐含量以及尿β2-微球蛋白/肌酐含量具有正相关关系。　　5.结论　　5.1 MALAT1在氯化镉恶性转化16HBE细胞模型中呈上调表达，并随着转化代数的增加而表达量升高，有剂量反应关系。提示镉细胞毒作用中存在MALAT1异常高表达。　　5.2 siMALAT1在氯化镉恶性转化16HBE细胞模型中影响体外细胞生物学行为，包括抑制各阶段细胞的增殖，阻滞细胞周期，降低细胞凋亡率，并降低细胞侵袭和转移能力，同时改变6个生物学行为相关因子FOXC2、BCL-2、BAX、STAT3、TGF-β1和EGFR的表达水平。　　5.3亚慢性镉染毒大鼠模型组织（肺、肝和肾脏）和镉暴露人群血液中的MALAT1均呈上调表达，其表达水平与镉暴露水平、6个生物学行为相关因子表达水平和脏器功能指标（尿β2-微球蛋白）含量呈不同程度的统计学相关关系。　　5.4综合上述体内外的实验研究和人群样本验证，从细胞、动物和镉暴露人群三方面初步论证了MALAT1的异常表达可作为新的镉毒性生物标志物，这为镉毒性反应的早期检测和机制研究提供了新的思路。