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芽孢杆菌是一种能形成芽孢的杆菌。此菌属最大特征是生成芽孢。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构,所以对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力。因此本属细菌对外界有害因子抵抗力强,分布广,存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处,与人类关系密切。如炭疽芽孢杆菌可以引起人、畜的炭疽病;蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌和产气荚膜梭菌引起食物中毒;破伤风梭菌引起破伤风;韦氏梭菌和产气荚膜梭菌引起气性坏疽等。由于芽孢对外界环境的极强适应力和抗性,一般处理方法不能把它杀死。所以针对芽孢的有效杀灭方法一直是消毒与预防医学领域研究的一个方向。传统上,一般使用高温灭菌法（121℃,30 min）达到彻底消除芽孢的目的,然而这种方法在实际应用中有着诸多不便。除了物理方法以外,杀灭芽孢的其他手段就大多借助一些高效化学消毒剂的使用,例如:含氯消毒剂、臭氧、甲基内酰脲类化合物、双链季铵盐,环氧乙烷等,可是这些化学类消毒剂在使用时都会对人体构成一定的伤害并且对环境造成一定的污染。于是结合我室主要研究方向,我们希望找到一种更加方便安全洁净的物质用于炭疽芽孢杆菌的洗消和预防。本研究中,经过一系列文献调研,我们最终选取了乳酸链球菌素Nisin与炭疽芽孢杆菌噬菌体裂解酶PlyG这两种蛋白类物质作为研究对象。乳酸链球菌素Nisin,一种新型低聚肽,是从乳酸链球菌发酵产物中提制的多肽抗菌素类物质,是世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。其一级结构由34个氨基酸组成,分子末端分别是氨基和羧基,还有5个硫桥构成内环,其分子式如下:C143H228N42O37S7,平均分子量为3510Da。Nisin主要抑制大部分革兰氏阳性菌的生长,包括产芽孢杆菌（如肉毒杆菌）、耐热腐败菌（如嗜热脂肪芽孢杆菌）等。它在食品防腐中的重要价值在于能抑制芽孢细菌（包括嗜热产气芽孢菌）。关于Nisin对微生物的作用机理方面有大量研究,目前普遍认为Nisin首先对革兰氏阳性菌细胞膜进行吸附,然后在细胞膜上形成空洞从而使胞内物质泄露,最后导致细胞解体死亡。在前期工作中,我们利用芽孢杆菌菌属常用指示菌枯草杆菌的芽孢进行的预实验已证明,Nisin能有效地杀灭处于萌发状态的枯草芽孢。而炭疽芽孢杆菌噬菌体裂解酶PlyG由233个氨基酸残基组成,是N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶,它通过破坏炭疽杆菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的交联而使其裂解。2002年, Schuch等人首次证实了γ噬菌体裂解酶（PlyG）可快速裂解生长中的RSVF1（炭疽芽孢杆菌类似株）并可有效地杀死感染小鼠体内的RSVF1病原菌。实验内容包括两部分:一.噬菌体裂解酶PlyG在大肠杆菌中的表达及鉴定。以炭疽γ-噬菌体作为模板,根据GenBank序列号为:DQ289556的序列设计引物,通过上升PCR的方法扩增PlyG基因,将其克隆入pET-22b（+）,DNA测序鉴定结果表明,所得的基因序列有两个位点发生突变,但是其所编码的氨基酸序列与预期一致。转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导,收集菌体,超声破碎,离心取上清经SP-XL离子层析柱进行纯化, SDS-PAGE结果显示目的蛋白获得高效表达,可溶部分占目的蛋白表达总量的40%。经过两步纯化,PlyG纯度达到95%,每升菌液可纯化得到约20mg纯品。氨基酸N端序列测定结果为:M-E-I-Q-K,与文献报道完全一致;二.Nisin与PlyG作用于芽孢杆菌的初步研究。首先借助OD650值测定Nisin与PlyG作用于RSVF1菌株的LD50,根据OD650显示,PlyG蛋白LD50为309μg/mL,Nisin LD50为672μg/mL。由于此研究的立题目的是探索Nisin与PlyG作用于芽孢的功效,所以我们利用RSVF1菌株进行了芽孢的制备,得到了含量≥99%的RSVF1芽孢。在前期利用芽孢杆菌菌属常用指示菌枯草杆菌的芽孢进行的预实验的过程中已证明,Nisin与PlyG对原始芽孢抑制或杀灭活性并不显著,而当原始芽孢经过一定的热处理（如65℃放置几十分钟）可以加速芽孢活化,使芽孢处于萌发状态。此时再加入Nisin或者PlyG,二者均能有效地杀灭处于萌发状态的芽孢,然而在实际应用中利用热处理来加速芽孢萌发的方法并不可行。我们发现浓度达100mmol/L的L-Ala是一种较为理想的芽孢萌发剂（溶剂为萌发缓冲液:10mmol/L NaH2PO4,100mmol/L NaCl,pH7.2）,为了验证其功效,我们将上述萌发剂进行芽孢萌发率的检测实验。在OD650≈1.0的RSVF1芽孢悬液中加入一定量的萌发剂L-Ala（溶剂为萌发缓冲液）使其在整个体系中终浓度达100mmol/L,37℃,萌发15min后检测试管中芽孢悬浮液在650nm的光密度。经计算芽孢萌发率为97.80%。最后利用平板计数法定量测定Nisin与PlyG对萌发RSVF1芽孢的杀灭率,实验结果证明,在加入萌发剂L-Ala后,Nisin对RSVF1芽孢的杀灭率从20.28%提高到99.37%,而PlyG对RSVF1芽孢的杀灭率从15.14%提高到99.12%。本研究初步探讨并比较了Nisin与PlyG作用于炭疽芽孢杆菌替代株RSVF1的功效,为其日后作为新型致病性芽孢杆菌消毒剂的开发与应用奠定了一定基础。实验过程中我们创新性地使用了萌发剂L-Ala,从而极大地提高Nisin与PlyG作用于炭疽芽孢杆菌替代株RSVF1芽孢的功效,这无疑提高了此类蛋白类消毒剂的应用价值。