随着人们生活水平的不断提高及社会老龄化问题的日益严重,心脑血管血栓性疾病发病率和致死率非常高,是中老年人的常见病和多发病,严重威胁人类的健康。临床上常见的急性心肌梗塞、脑血栓和弥漫性血管内凝血(DIC)多数为动脉血栓,是致死或致残的主要原因之一；血液凝固异常是这一类疾病的发生、蔓延及干预中最为关键的环节。血栓性疾病在急性发病前需及早干预治疗,发病后经溶栓治疗,需要长期用药,预防血栓再次形成而复发。肝素和维生素K是临床上常用的抗凝治疗药物,已有近百年的历史。然而,在临床使用过程中,不断地发现肝素、维生素K等用于抗凝治疗时会引发不良反应,限制了它们的使用范围。而凝血酶作为血液凝固的关键因子,成为临床上预防血栓形成的重要靶点。水蛭素是特异性的凝血酶抑制剂,并且是一种直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitors, DTIs),临床上用于防治血栓疾病,有着重要的应用价值。我们实验室研制、开发了重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin),中国发明专利“一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用”已授权,专利号：ZL01105798.X。RGD-Hirudin是在野生型水蛭素分子的合理部位融合了Arg-Gly-Asp (RGD)三肽,使这种水蛭素衍生物既保留了抗凝血酶活性,又增加了抑制血小板聚集的活性,具有降低血黏度,抗栓、防栓等作用。经过药效学研究证明用于血管吻合术后抗凝治疗,疗效优于野生型水蛭素和肝素。但是RGD-Hirudin是一种蛋白质/多肽类药物,只能通过静脉注射的给药方式用药,临床应用范围有限。目前,已有四种注射用DTIs及一种口服DTI成功用于临床。然而,这些药物的临床适应症状单一,每种DTI都针对特定的病症,且治疗费用昂贵。所以,开发新型DTIs(包括注射和口服给药方式)无论在治疗和预防血栓栓塞疾病方面还是在经济效益方面都具有极为广阔的前景。本项研究的主要目的是从重组双功能水蛭素的结构和功能研究入手,发现其与凝血酶相互作用的重要位点,阐明两者相互作用机制,对双功能水蛭素作进一步的改造,设计和研制具有抗凝活性的小分子多肽,用于开发口服或皮下注射的抗凝防栓药物。本论文研究内容主要包括四个部分：1.利用毕赤酵母表达系统,通过高密度发酵的方法,采用适当纯化方案,以13C甘油、13C甲醇分别为生长阶段和诱导阶段提供碳源；以15N硫酸铵为氮源,对RGD-hirudin作15N/13C均一标记,经发酵和纯化,获得15N/13C全标记RGD-hirudin,对其纯度、分子量及生物学活性进行了鉴定,为深入开展构效关系研究打下了良好的基础。2.利用多维核磁共振技术,对15N/13C均-标记的RGD-hirudin作了1D’H谱,3D CBCA(CO)NH谱,3D CBCANH谱,3D HNCO谱,2D1H-15N HSQC谱的测定,并对骨架共振信号进行了归属指认。利用化学位移扰动实验研究了15N/13C均匀标记的RGD-hirudin与凝血酶的相互作用位点,明确了RGD-hirudin的关键氨基酸残基位点。3.利用同源建模的方法模拟了RGD-hirudin的全长结构,通过分子对接的方法得到RGD-hirudin与凝血酶复合物的模型结构,结合NMR化学位移扰动实验的结果,对RGD-hirudin与凝血酶的相互作用进行了深入的分析。为了验证复合体模型的准确性,进一步对两者相互作用过程中,与凝血酶形成氢键的RGD-hirudin氨基酸残基进行了虚拟丙氨酸扫描,分析突变体稳定性及合理性。利用重组DNA技术,将计算机模拟得到的关键氨基酸残基作丙氨酸单点突变,获得了6个RGD-hirudin的突变体。测定了这些突变体的抗凝活性和抗血小板聚集的活性；利用表面等离子共振实验(SPR)分别测定了RGD-hirudin和这些突变体与凝血酶相互作用的亲和力。确认RGD-hirudin与凝血酶相互作用关系,即RGD-hirudin的C-末端与凝血酶exosites I结合,N-末端与凝血酶活性位点结合,抑制凝血酶活性。4基于RGD-hirudin的结构功能研究结果,以RGD-hirudin的序列为基础,保留其与凝血酶结合的功能氨基酸残基,借助分子模拟软件(Discovery Studio3.0)设计了两条具有抗凝活性的小分子短肽。以毕赤酵母为宿主菌表达上述短肽肽,纯化后测定抗凝血酶活性,HPLC测定纯度,MS测定分子量,结果显示两条短肽具有抗凝活性,分子量分别为3925.5247Da(35肽)和4024.5459Da(36肽)。