论文部分内容阅读
目的:本研究从磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路入手,采用细胞培养、生化检测试剂盒、RT-PCR和Western Blot等技术手段,探讨并观察经典名方六味地黄丸对H2O2损伤PC12细胞凋亡的保护作用,从分子生物学角度揭示六味地黄丸对神经细胞凋亡抑制的作用机制,为六味地黄丸治疗阿尔茨海默病提供实验依据及理论基础。材料与方法:按照体重将大鼠随机分为空白对照组和六味地黄丸组。其中六味地黄丸组采用生药质量浓度为0.75 kg/L六味地黄丸(浓缩丸)水溶液按照10m L/kg灌胃,每天上午、下午各灌胃一次,空白对照组同体积双蒸水灌胃,连续灌胃7天,第7天首次给药2小时后腹主动脉取血,静置2h,2000 r/min离心10 min后分离血清。经56℃,30min灭活,0.22μm滤膜过滤灭菌,-20℃保存备用。取对数生长期的PC12细胞按照1×105/ml密度,接种于96孔板中培养,200μl体系,待培养24小时细胞贴壁生长后,更换无胎牛血清的培养基,继续培养24h后将终浓度分别为100、150、200、250、300、350μmol/L的H2O2加入到细胞培养基中,作用时间分别为12、24、36、48小时,确定H2O2诱导PC12细胞损伤的最佳作用时间及作用剂量。选取空白对照组大鼠的血清以及六味地黄丸灌胃组大鼠血清分别制备5%、10%、20%血清浓度的细胞培养基。在96孔板内,按照上述浓度接种细胞,饥饿24h使细胞同步化后,加入含相应浓度大鼠血清的细胞培养基在细胞造模前进行保护,MTT检测细胞存活率,选取适宜的含药血清浓度及适宜的保护时间。同样方法选择阳性对照药Vit E的作用浓度备用。将PC12细胞分成四组,分别为(1)对照组、(2)模型组、(3)六味地黄丸含药血清组、(4)Vit E组。待各组细胞接种24h,更换无胎牛血清的DMEM培养基培养24h后,(1)、(2)组加入含有10%正常大鼠血清的DMEM培养基培养24h,(3)组加入含有六味地黄丸含药血清的DMEM培养基培养24h,(4)组加入含有10%正常大鼠血清和Vit E的DMEM培养基培养24h,之后(2)、(3)、(4)组均加入终浓度为200μmol/L的H2O2作用24h,显微镜下观察细胞形态,同时收集细胞或上清液,检测LDH、SOD、MDA等生化指标。明确六味地黄丸含药血清是否对过氧化氢损伤的PC12细胞具有保护作用。收集上述四组细胞进行细胞凋亡率和细胞凋亡相关基因(caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bax、Bad、Bcl-2)m RNA和蛋白测定。明确六味地黄丸含药血清是否对PC12细胞的凋亡具有抑制作用。将PC12细胞分成五组,分别为(1)对照组、(2)模型组、(3)六味地黄丸含药血清组、(4)Vit E组、(5)PI3K抑制剂组。其中(1)、(2)、(3)、(4)组处理同前,(5)组在H2O2诱导PC12细胞凋亡前30分钟,加入PI3K抑制剂。收集细胞,提取各组细胞总蛋白,western blot法检测PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达。提取各组细胞内总RNA,使用RT-PCR法检测PI3K、Akt的m RNA表达,明确六味地黄丸对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用是通过PI3K/Akt信号转导通路介导的。结果:1六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用1.1六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞增殖率的影响经筛选确定200μmol/l的H2O2作用24h作为PC12细胞损伤的刺激条件。用不同浓度的六味地黄丸含药血清对细胞进行干预保护,与各模型组相比,5%浓度六味地黄丸含药血清保护24h、36h,细胞OD值及增殖率有增加趋势,但差异不显著(P>0.05);10%六味地黄丸含药血清保护24h,细胞OD值及增殖率显著性增高(P<0.01);20%浓度六味地黄丸含药血清保护12h、24h和36h后,细胞OD值及增殖率有增加趋势,但差异不显著(P>0.05)。最终选用10%浓度六味地黄丸含药血清保护24h作为最佳治疗条件。1.2六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞一般形态的影响在倒置显微镜下,空白对照组细胞为梭形,细胞的胞体大,胞体主干和分支延长并增粗,细胞间接触紧密,有伪足伸出,细胞数目多,增殖旺盛,折光度强,少见脱壁漂浮的细胞;模型组细胞突触变短或伪足消失,部分细胞皱缩、变圆、脱落、漂浮于培养基,细胞间隙增宽,细胞数量少,折光减弱,生长状态差。六味地黄丸组细胞重新伸出伪足,间隙减小,细胞贴壁数量增多,漂浮细胞减少,折光度增强,细胞生长状态好转。1.3六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞培养基中LDH的影响正常对照组细胞培养基中LDH含量较低;与之相比,H2O2损伤后细胞培养基中LDH含量显著性增加(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,LDH含量显著性下降(P<0.01)。1.4六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞MDA含量的影响正常对照组细胞内MDA含量较低;与之相比,H2O2损伤后细胞内MDA含量显著性增加(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,MDA含量显著性下降(P<0.01)。1.5六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞SOD活力的影响正常对照组细胞内SOD活力较高;与之相比,H2O2损伤后细胞SOD活力显著性下降(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,SOD活力显著性升高(P<0.01)。2六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞凋亡的影响2.1 Annexin V-EGFP/PI双染色法观察六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞凋亡的影响各组细胞Annexin V-PE/PI染色后,在倒置荧光显微镜下观察,正常对照组荧光较少弱,凋亡细胞数量少;模型组视野范围内,荧光强度较强,染色细胞很多,凋亡细胞数量很多;与模型组相比,六味地黄丸组和Vit E组染色细胞减少,凋亡细胞数量减少。与正常对照组相比,模型组凋亡率显著性升高(P<0.01)。而六味地黄丸含药血清组与模型组相比,凋亡率显著降低(P<0.01),下降到29.18%±3.71%。2.2六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞Bcl-2、Bad、Bax m RNA和蛋白表达的影响与正常对照组相比,模型组Bcl-2的m RNA和蛋白表达显著减少(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,Bcl-2的m RNA和蛋白表达显著增加(P<0.01);与正常对照组相比,模型组Bax、Bad m RNA和蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01);而六味地黄丸组与模型组相比,Bax、Bad m RNA和蛋白表达显著下降(P<0.05);2.3六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8 m RNA和蛋白表达的影响与正常对照组相比,模型组Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 m RNA和蛋白表达显著升高(P<0.01);而六味地黄丸组与模型组相比,Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3m RNA和蛋白表达显著下降(P<0.01,P<0.05,P<0.01);3六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞PI3K/Akt信号通路的影响与正常对照组相比,模型组PI3K、Akt m RNA和PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达显著下降(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,PI3K、Akt m RNA和PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达显著升高(P<0.01);与六味地黄丸组相比,PI3K抑制剂组的PI3K、Akt m RNA和PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达显著下降(P<0.01)。结论:1使用H2O2外源性氧化剂,成功模拟建立稳定的PC12细胞氧化损伤模型。2六味地黄丸含药血清能够促进H202损伤的PC12细胞增殖,其中10%浓度六味地黄丸含药血清保护24h对于H202损伤的PC12细胞增殖率提高最有效。3六味地黄丸含药血清对H202损伤的PC12细胞具有保护作用。其可以保护细胞膜结构完整,减少细胞形态的改变,降低细胞LDH漏出量及MDA含量,增加细胞SOD活性,增强细胞抗氧化能力,抑制细胞氧化损伤。4六味地黄丸含药血清可以降低H202损伤的PC12细胞的凋亡率,具有抑制细胞凋亡作用。5六味地黄丸含药血清能够显著性下调Bax、Bad m RNA和蛋白的表达,上调Bcl-2 m RNA和蛋白的表达,发挥其抑制细胞凋亡的保护作用。6六味地黄丸含药血清能够显著性下调Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9 m RNA和蛋白的表达,发挥其抑制细胞凋亡的保护作用。7六味地黄丸含药血清能显著促进PC12细胞PI3K m RNA、Akt m RNA及PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达。PI3K抑制剂LY294002可以显著阻断六味地黄丸含药血清对PC12细胞PI3K m RNA、Akt m RNA及PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达,提示六味地黄丸含药血清通过PI3K/Akt信号通路发挥其抑制H202损伤的PC12细胞凋亡作用,防治AD的发生发展。