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背景脑缺血后,缺血组织区的修复需新生血管提供营养物质,维持其正常的组织代谢。尽快的恢复缺血脑组织的血流供应,挽救缺血半影区濒临死亡的神经元,有利于神经功能的恢复,是缺血性脑血管病治疗的关键。超早期的溶栓治疗由于时间窗及其本身的成功率,在临床应用中受到限制;扩管、抗凝、抗血小板等治疗疗效欠佳。如何通过调动内源性的血管生成机制促进缺血区毛细血管生成,侧枝循环的重建已成为目前研究的热点。电针通过刺激体表穴位激活机体体内保护机制,是治疗脑缺血疾病较为有效的一种非药物手段。近年研究发现,内皮前体祖细胞(EPCs)与脑缺血后的血管再生密切相关。脑缺血后,一些细胞因子在脑内释放,通过激活相关信号转导通路发生一系列级联反应,促进EPCs从骨髓释放入血,并向缺血组织区归巢。PI3K/AKT是具有代表性的与EPCs增殖、迁移、归巢相关的信号转导通路。而基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)与CXCR4结合后可激活PI3K/AKT信号转导通路。本实验组既往研究发现,电针可能通过上调基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的表达而促进缺血区大脑的血管再生。但电针促进EPCs向脑内归巢的机制仍不清楚,本实验从这一问题出发进行探讨。本课题将着重研究电针刺激下,脑内AC133标记的EPCs表达的时空变化规律;电针是否增强影响EPCs增殖、迁移、归巢的PI3K/AKT信号转导通路的激活;PI3K/AKT信号转导通路特异性阻断剂LY294002作用下,电针对PI3K/AKT信号转导通路激活作用是否减弱。初步明确电针刺激促进EPCs归巢形成新生血管的可能机制,为电针治疗缺血性脑血管病提供实验依据。目的1.探讨电针干预对局灶脑缺血/再灌注大鼠脑缺血侧AC133时空表达规律,初步明确电针对EPCs归巢是否有促进作用;2.探讨PI3K/AKT信号转导通路在局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内血管再生中的作用;3.探讨电针及LY294002干预对PI3K/AKT信号转导途径活化的影响,初步明确电针处理促进EPCs归巢形成新生血管的可能机制。方法采用线栓大脑中动脉法制备局灶脑缺血/再灌注模型(MCAO模型),80只雄性成年SD(Sprague-Dawley)大鼠,分为对照组(NC组)、模型组(I/R组)、电针组(I/RE组)、LY294002+电针组(I/RA组)。I/R组和I/RE组分别包括1d、3d、7d 3个时相点。每个时相点10只大鼠。I/RE组和I/RA组取大鼠双侧“合谷”(LI 4)穴作为体表刺激位点,电针治疗仪选用疏密波刺激,刺激时间15min/次,1次/d,7d为一疗程。I/RA组选择再灌注3d为观察时相点,I/RA组大鼠于缺血2h后,电针刺激前1h进行侧脑室打LY294002。NC组、I/RA组各10只大鼠。神经症状学评分用于评估局灶脑缺血/再灌注后大鼠神经功能缺损状况。HE染色观察脑梗塞后大鼠脑组织病理学变化。免疫组化检测再灌注后各个时间点大脑组织p-AKT1、AC133蛋白表达;逆转录聚合酶链法(reverse transcription- polymerase chain reaction,RT-PCR)检测脑皮质AC133 mRNA表达;免疫印迹法(Western blot)定量检测总AKT、p-AKT1蛋白表达。结果1.神经症状学评分再灌注2h,1d,3d时,I/RE组和I/RA组神经症状学评分均逐渐减少,两组各对应时间点比较无显著差异(p>0.05)。随着缺血再灌注时间延长,评分进一步减少,大鼠神经功能有所恢复。再灌注7d时,I/RE组与I/RA组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。2. AC133 mRNA半定量分析NC组脑组织中少量AC133 mRNA表达,再灌注1d、3 d、7 d,I/R组AC133 mRNA表达随再灌注时间延长呈单峰样增加。I/R组与NC组比较,再灌注1d表达无差异(P>0.05),再灌注3d明显增加(P<0.05),再灌注7d达峰值(P<0.01)。I/RE组与I/R组比较,再灌注3d、7 d时,I/RE组AC133 mRNA表达高于I/R组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在阻断剂LY294002作用下,AC133 mRNA表达明显低于I/RE组和I/R组(P<0.05),与NC组表达无差异(P>0.05)。3. AC133蛋白免疫组化结果分析NC组AC133蛋白表达阴性。I/R组再灌注3d时发现少量AC133蛋白表达,脑缺血半影区可见着色较浅黄染细胞,其余各时间点均为阴性。I/RE组再灌注3d、7d发现AC133蛋白表达增多,与同时间点I/R组比较有统计学意义(P<0.05)。在LY294002作用下,AC133蛋白表达为阴性。4. p-AKT1蛋白免疫组化结果分析NC组和I/RA组脑组织切片未发现黄染细胞,p-AKT1表达阴性。I/R组p-AKT1主要表达于脑缺血半影区,在缺血侧脑组织可见部分黄染细胞,对侧同部位脑组织未见类似黄染细胞。缺血半影区p-AKT1表达于再灌注1d达高峰(P<0.01),3d开始有所下降(P<0.01),7d仍高于NC组(P<0.05);I/RE组与I/R组比较,再灌注1d时,I/RE组p-AKT1表达无明显差异(P>0.05),再灌注3d、7d时,I/RE组p-AKT1表达明显高于I/R组,差异具有统计学意义(P<0.01)。5. p-AKT1蛋白Western blot结果分析p-AKT1蛋白为一60KD条带,与其实际分子量大小相符合。在正常脑组织中,脑内有少量p-AKT1表达。与NC组比较,I/R组p-AKT1的表达逐渐增加,于再灌注1d时达高峰(P<0.01),3d时开始有所下降(P<0.01),7d时仍高于NC组(P<0.05)。I/RE组在再灌注后3d、7d时p-AKT1的表达明显增加,于再灌注3d时表达达高峰,7d时表达开始下降,与同时相的I/R组想比较具有统计学意义(P<0.01)。在LY294002阻断剂的作用下,再灌注3d时,大鼠p-AKT1蛋白的表达较I/RE组显著减少(P<0.01),与NC组比较无显著差异(P>0.05)。而AKT蛋白表达各组之间比较无明显差异(P>0.05)。结论1.电针可能激活内源性的血管生成机制,改善局灶性脑缺血/再灌注大鼠神经功能缺损,促进了大鼠肢体功能恢复;2.电针可能促进循环EPCs向局灶脑缺血/再灌注大鼠脑缺血半影区归巢;3.电针可促进AKT活化,激活PI3K/AKT信号转导通路信号通路,促进血管再生;4.电针可能通过加强PI3K/AKT信号转导通路的激活,促进EPCs归巢至缺血组织区参与血管再生。