论文部分内容阅读
布鲁氏菌病（Brucellosis）由布鲁氏菌(Bruce1la)侵入机体引起，以流产、不育和弛张热为临床特征的人兽共患病。该病在人畜间广泛流行，世界170个国家和地区均有该病的发生，在我国新疆和青海两省尤为突出，给畜牧业生产和人类健康带来了严重的危害。布鲁氏菌是典型的胞内寄生菌，主要以细胞免疫为主，T细胞在其诱导的免疫应答中发挥着重要作用。CD4~+CD25~+T细胞（Treg）对免疫应答具有调节功能，主要表现为免疫无反应性和免疫抑制性，可以通过下调机体的免疫应答来维持机体稳定和免疫耐受，当Treg细胞数量低下和功能紊乱可导致多种疾病的发生。Foxp3(Forkheadboxp3)是特异性表达在Treg细胞上的一类转录因子，Foxp3的活化对Treg细胞发育和转化有较大的影响。对Treg细胞的免疫调控研究将有助于对布鲁氏菌免疫机制的理解及防治新策略的制定。目前Treg细胞是否参与了绵羊对布鲁氏菌M5-90弱毒的免疫反应调控尚不清楚，为了探讨Treg细胞在布鲁氏菌M5-90弱毒疫苗诱导机体免疫应答中的作用，本项目主要开展了以下研究工作：1、外周血CD4~+、CD8~+T、CD4~+CD25~+Treg在绵羊接种布鲁氏菌M5-90弱毒疫苗后的动态变化：以布鲁氏菌M5-90弱毒间隔10天接种布病阴性绵羊，共接种三次，颈静脉采血，新鲜血液2小时内流式细胞仪测定Treg细胞及T细胞亚群并进行分析；结果显示CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞均在第20天达到显著升高水平，前者为40.44%，后者为28.79%，而后均开始降低；Treg细胞自接种后处于上升趋势，第30天时达到9.07%的最高水平；而CD4~+/CD8~+则始终保持在1.49的水平。研究结果提示Treg细胞参与了布鲁氏菌M5-90弱毒疫苗的免疫应答调控，Treg细胞的上调抑制了CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞的增殖，且维持机体Th1/Th2细胞之间反应的平衡；2、绵羊接种布鲁氏菌M5-90弱毒疫苗后IL-1β、IL-6及抗体水平检测研究：分离血清，以虎红平板凝集试验和试管凝集试验相结合的方法进行布鲁氏菌抗体水平的测定，在接种的第10天、20天、30天，抗体阳性率均为100%，且一免后即达到阳性，二免时水平最高，三免时略微下降；用ELISA方法检测了IL-1β、IL-6的变化，发现IL-1β总体呈缓慢升高趋势，三免时达到显著水平，IL-6则缓慢下降，但各阶段变化均不显著；布鲁氏菌抗体水平及IL-1β、IL-6等细胞因子的变化提示Treg细胞参与了布鲁氏菌M5-90弱毒疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答过程，且IL-1β可能起到促进Treg细胞扩增的作用；3、绵羊接种M5-90后Treg细胞中Foxp3基因表达的检测研究：分离淋巴细胞，提取RNA，根据GenBank上的绵羊Foxp3基因mRNA序列和内参基因序列分别设计引物，采用realtimeRT-PCR技术分析Foxp3基因的表达情况。结果Foxp3基因表达随着免疫次数的增加呈升高趋势，第30天时相对表达量达到高峰；提示其促进了Treg细胞的发育与转化并协助Treg细胞发挥免疫抑制功能。本研究证实Treg细胞参与了绵羊对布鲁氏菌M5-90弱毒的免疫反应调控，并对CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞的增殖进行抑制，且维持CD4~+/CD8~+比值稳定，起到平衡Th1/h2细胞之间反应的作用；Foxp3基因的变化与Treg细胞一致，提示其参与了Treg细胞的发育与转化，协助其实现免疫抑制功能。本项研究将有助于初步阐明布鲁氏菌诱导机体免疫应答的分子机制。