副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为一种常见的食源性致病菌,其引起的食物中毒事件在世界各地频繁发生,且已被视为全球范围内腹泻类疾病暴发的主要原因之一。副溶血性弧菌耐药性问题已引起人们的高度关注,但对副溶血性弧菌耐药性发生微进化的原因暂未有详解。全基因组测序技术的应用,有助于监测抗生素耐药性的出现和传播,可预测微生物潜在的耐药机制,进一步探明细菌获得耐药性的原因,在疾病的诊断、治疗、新药物的研发中发挥巨大的作用。因此,为清楚了解副溶血性弧菌耐药性微进化的机制,本文进行了如下的研究工作:(1)食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药性研究;(2)一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法;(3)敏感型与获得耐药型的副溶血性弧菌生物性状变化研究;(4)全基因组测序追踪副溶血性弧菌的耐药性微进化机制。本研究的主要研究内容和研究结果如下:1.食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药性研究探究食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药性差异,为副溶血性弧菌耐药机制的研究提供数据基础。运用K-B纸片法,对上海市46株不同来源的致病性副溶血性弧菌(28株临床菌株、18株食品源菌株)进行耐药性监测,并通过PCR技术分析菌株的耐药基因携带情况。进一步利用多位点测序技术揭示46株副溶血性弧菌的遗传多样性,针对相同进化分支中不同来源的分离株进行耐药性比较。结果显示28株临床菌株的耐药率(100%)明显高于18株食品源分离株(88.9%),其中,临床菌株全部为多重耐药性菌株(n=28),而食品源中仅有2株存在多重耐药性现象。耐药基因分析结果显示:对比于食品源分离菌株,临床菌株所携带的耐药基因数量更多,种类也更为丰富。多位点测序分型结果也显示出相同的趋势,即在同一进化分支中,临床菌株的耐药性也显著高于食品分离株。本研究首次系统地比较了食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药表型与耐药基因型的差异,并从微进化的角度初步分析了其耐药性形成的原因,为副溶血性弧菌耐药性的起源、传播与控制提供可靠的数据支持。2.一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法本研究建立了一种快速诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法。主要步骤如下:1.敏感菌株筛选:通过肉汤倍数稀释法,确定左氧氟沙星抑制敏感型菌株的最低抑菌浓度(MIC),筛选出左氧氟沙星敏感型的副溶血性弧菌菌株。2.亚致死抗生素浓度初步诱导:对1/2MIC中可生长的敏感型菌株的菌液处理后,接种于含有不同浓度抗生素的96孔板中培养。3.亚致死抗生素浓度连续诱导:重复该方法,使该菌株持续存在于亚致死的抗生素浓度条件下生长,直至副溶血性弧菌产生左氧氟沙星的耐药性,即其MIC值达到CLSI规定的耐药标准。4.耐药性菌株的保藏:对诱导后培养至9 Log CFU/mL的突变株进行菌种保藏。5.获得耐药性的验证:将保藏的突变菌株重新活化,连续传代培养5天,并用两种不同的药敏试验方法检测突变株的耐药性,以确定该突变株获得了能够稳定遗传的耐药性。结果显示,诱导后的副溶血性弧菌获得了左氧氟沙星耐药性,其MIC值均达到了CLSI的耐药标准,并且这种耐药性能够稳定地遗传。本研究构建了一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法,可快速获得具有稳定遗传特性的耐药性菌株,为副溶血性弧菌对左氧氟沙星耐药机制的研究具体提供了一种可靠的工具,具有良好的科研价值和实际意义。3.敏感型与获得耐药型的副溶血性弧菌生物性状变化研究为了研究敏感型与获得耐药型的副溶血性弧菌生物性状的差异性,本文针对敏感型的副溶血性弧菌VPD14与获得耐药型的副溶血性弧菌VPD14M的耐药性、微观结构、生长能力、运动性、生物被膜等进行了探究。结果显示:获得左氧氟沙星耐药性的菌株VPD14M同时获得了同种类抗生素环丙沙星的耐药性,失去了对氨基糖苷类抗生素的抗性。敏感型菌株VPD14与获得耐药型菌株VPD14M在微观结构上没有明显的差异,但是敏感型菌株的生长能力和运动性明显强于获得耐药型的菌株。同时发现,获得耐药型的菌株VPD14M生物被膜的形成能力更强,生物被膜的形成量和厚度都显著高于敏感型菌株。本研究全面系统地分析了敏感型与获得耐药型的副溶血性弧菌生物性状的差异性,为副溶血性弧菌耐药性微进化机制的初探提供了可靠的基础数据。4.全基因组测序追踪副溶血性弧菌的耐药性微进化机制为探究副溶血性弧菌获得耐药性的原因,进一步揭示其耐药性微进化的初步机制。本研究基于全基因组测序技术,利用第二代测序技术与第三代测序技术的结合,比较了敏感型的副溶血性弧菌VPD14与获得耐药型的副溶血性弧菌VPD14M在基因组上的差异性。进一步分析了敏感型菌株与获得耐药型菌株的抗生素抗性基因的相似度。结果显示:敏感型菌株VPD14的基因组全长为1,282,695,483bp,GC含量为42.84%。该菌株含有两条环状染色体,大小分别为3,291,121bp和1,877,519bp,GC含量分别为45.38%和45.36%。获得耐药型的菌株VPD14M的基因组全长为5,089,287bp,GC含量为45.29%。通过比较基因组发现,敏感型菌株与获得耐药型菌株携带的耐药基因分别为50种和48种,其中91.7%的基因序列完全相同。仅有gyrA,parC,gyrB等3个喹诺酮类的基因发生了单个碱基的突变且为非同义突变。因此,本研究从比较基因组学的层面上,初步揭示了副溶血性弧菌耐药性微进化的潜在机制:即在亚致死浓度抗生素的刺激下,副溶血性弧菌为适应环境,其耐药基因gyrA,parC,gyrB发生突变,从而导致其产生相应的喹诺酮类抗生素耐药性。