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背景随着人民生活水平的提高,高尿酸血症的患病率呈逐年上升趋势。越来越多的流行病学研究提示,高尿酸血症与心血管疾病的发生及预后有一定相关性,但人血清尿酸水平是否是心血管疾病的独立危险因素尚不能定论。血管内皮功能障碍是心血管疾病发生的基础,但由于体外建立内皮细胞模型的方法不一,关于尿酸如何影响血管内皮功能的基础研究结果存在着很大的差异。目的探索建立类似生理状态的内皮细胞体外研究模型；并在此基础上研究尿酸独立和/或ox-LDL体外对血管内皮功能的影响,为合理治疗高尿酸血症提供一定的实验基础。内容及方法本研究分为2个部分,第1部分是体外血管内皮细胞模型的建立：将HUVEC体外培养于不同培养基条件下,观察细胞形态学的改变,并于不同增殖点进行细胞计数来分析细胞生长曲线；最后通过给予不同浓度ox-LDL刺激HUVEC24h后,观察各培养基条件下HUVEC eNOS的表达情况,从而确定适宜的体外内皮细胞模型。第2部分是应用第1部分建立的体外细胞模型,研究尿酸对血管内皮功能的影响：1)不同浓度的尿酸(5、10、15及20mg/dl)单独作用于HUVEC24h、48h及72h后,通过Real-time PCR、Western blotting方法观察HUVEC eNOS及ICAM-1的表达,并应用硝酸还原酶法及ELISA法分别测定上清中NO及s-ICAM的水平,综合分析尿酸单独作用下对血管内皮功能的影响；2)在50μg/ml ox-LDL存在时,不同浓度的尿酸(5mg/dl及20mg/dl)分别作用HUVEC 24h、48h及72h后,应用Real-time PCR法观察HUVEC eNOS及ICAM-1的变化,进而评价尿酸联合ox-LDL共同作用下血管内皮功能的情况。结果第1部分：HUVEC培养于完全ECM或2:1ECM/DMEM培养基下,细胞指数增长高峰出现于24h之内并持续至72h; HUVEC培养于1:1ECM/DMEM培养基中细胞指数增长高峰出现于24h左右,生长情况最符合体外细胞培养规律；HUVEC培养于1:2ECM/DMEM培养基中,显微镜观察内皮细胞性状不能保持,且生长曲线没有明显指数生长期。50μg/ml ox-LDL在3种培养基条件下都能明显下调内皮细胞eNOS的表达,20μg/ml ox-LDL可以使培养于1：1或2:1ECM/DMEM培养基中的HUVEC表达eNOS减少,而在1:1ECM/DMEM培养基条件下,10μg/ml ox-LDL即可导致HUVEC表达eNOS降低(P<0.05),表明这个培养条件可以敏感反映低浓度的ox-LDL对血管内皮的损伤。第2部分：1)高浓度尿酸(10、15及20mg/dl)单独作用HUVEC 24h、48h及72h时,可以使eNOS mRNA及蛋白表达降低,上清中NO产生减少(P<0.05)；同时,明显上调HUVEC ICAM-1 mRNA的表达(P<0.05),但仅24h时出现ICAM-1蛋白表达的下降以及上清s-ICAM的升高(P<0.05),且二者的变化趋势正好相反,提示s-ICAM可能是由细胞表面ICAM-1蛋白断裂脱落而来,综合分析ICAM-1的表达在尿酸刺激后上调。因此,高浓度尿酸可以损伤内皮功能,并呈现一定的时间依赖性。5 mg/dl的尿酸在各时间点对eNOS的表达、NO的产生以及ICAM-1 mRNA及蛋白的表达都没有影响(P>0.05),但在48h及72h时显著降低上清s-ICAM的水平,提示正常生理水平的尿酸存在不仅不会损伤内皮,还可能参与内皮的保护机制。2)当50μg/ml ox-LDL存在时,尿酸5及20 mg/dl都会显著下调HUVEC eNOS的表达,且下调程度要重于正常条件下尿酸的下调力度(P<0.05),说明尿酸与ox-LDL对内皮的损伤有明显的协同作用,当ox-LDL存在时,任何水平的尿酸都有可能进一步加重内皮受损程度。但当二者共同刺激HUVEC 24及48h时,会下调ICAM-1的mRNA的表达(P<0.05),考虑可能是短期内内皮功能代偿保护的结果。结论第1部分：1:1 ECM/DMEM体外培养的HUVEC是较为合适的体外内皮细胞模型,可以敏感反应血管内皮损伤。第2部分：高出生理浓度的尿酸单独作用于正常血管内皮时会损伤内皮功能,并呈时间依赖性。生理浓度的尿酸对正常的血管内皮没有损伤,甚至可能保护内皮功能,说明生理浓度的UA的存在是有意义的。当有ox-LDL存在时,任何水平的尿酸存在都会进一步减少eNOS的表达,严重损伤血管内皮功能,提示对于高脂血症的患者甚至其他内皮功能受损的人群,即使生理浓度的尿酸存在也有其危险性。