目的纤支镜刷检因简便、快捷、经济、实用且准确性高而成为诊断肺癌的重要方法之一。然而,当癌细胞异型性不明显或数量较少时,临床上经常出现高度可疑为肺癌,反复的细胞学检查却是阴性的结果。这可能是由于玻片中的癌细胞被大量的红细胞、坏死碎屑和大量粘液所掩盖。液基细胞学检测系统(Liquid-based Cytological Test, LCT)通过祛除标本内的粘液、杂质及炎性细胞,制成视野清晰的薄层涂片,在宫颈细胞学诊断上已得到了细胞学工作者的一致认可。目前宫颈癌的筛查方法多采用宫颈脱落细胞学检查和HPV病毒检测。尽管细胞学检查大大降低了宫颈癌的发病率和死亡率,但由于细胞量有限降低了其敏感性,需要频繁的随访调查；HPV检测敏感性很高,但大部分HPV阳性病人会自动转阴,仅少部分HPV阳性病变最终会发展到宫颈癌,限制了其在临床使用的有效性。因此,建立科学、有效的诊断方法是提高肺癌和宫颈癌诊断阳性率的有效途径,也是提高宫颈癌和肺癌患者生存率与治愈率的关键。本课题以肺癌和宫颈癌为主攻对象,以宫颈和纤支镜刷检液基细胞学标本为检测基础,采用FISH方法测定癌前病变及癌细胞中hTERC基因的表达；探讨hTERC基因的表达与细胞学及组织学诊断结果之间的关系,对诊断肺癌和宫颈癌的临床应用价值。方法收集中国医科大学附属第一医院2008年1月至2008年10月门诊及住院肺癌患者术前纤维支气管镜刷检标本204例。鳞癌104例,腺癌44例,小细胞癌56例,以及肺良性疾病患者40例(包括炎症20例和结核20例)。其中随机选取102例用于FISH检测。收集中国医科大学附属第一医院2008年3月至2008年10月宫颈液基细胞学标本123例。其中20例为无上皮内病变及恶性病变,103例分别做了细胞学检查及宫颈活检。1、液基细胞学检测(1)标本的处理,将刷检标本用传统涂片方法涂2张,巴氏染色。余下部分倒入含有CytoRich保存液的小瓶中,每一体积气管镜刷检标本加入CytoRich保存液；每10mL加入1mL粘液溶解液,混合后放置30min,震荡器上震动10s,如混合液中仍有凝结,可再增加一些粘液溶解液,直至粘液溶解。(2)制片,将溶解后的标本倒入50mL的离心管中,按2000r／min离心10min,离心后去上清,加去离子水至7.5mL,重新震荡混匀,按上述标准再离心5 min,弃上清,震荡离心管,放在AutoCyte机器上制片、染色。2、荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)检测hTERC基因的扩增(1)收集液基瓶中的细胞制成玻片。(2)待测样本与探针杂交。(3)荧光显微镜观察并分析结果。结果1、传统细胞学涂片由于受粘液丝、炎性细胞及坏死细胞碎屑的干扰,204例肺癌中仅有118例发现了癌细胞,敏感度仅为57.8%；而LCT法图片背景干净、细胞图像清晰,其敏感度达71.6%,两者之间有统计学意义(P<0.05)。但两者联合应用,其敏感度高达76.5%。与传统细胞学相比,差异有统计学意义(P<0.01)。2、hTERC基因扩增与病变程度有关(p<0.005)。肺癌患者hTERC基因扩增的百分比明显高于非恶性病变的患者(p<0.005)；NSCLC患者hTERC基因扩增的百分比明显高于SCLC患者(p<0.005)。3、102例支气管刷检中,其中使用细胞学检查发现84例敏感性为82.4%,而FISH检测89人为阳性敏感性为87.3%,两种方法无统计学差异(P>0.05)。但在鳞癌诊断两种方法有统计学差异(P<0.01)。4、hTERC基因扩增与病变程度有关(p<0.005)。细胞学分组中HSIL及SCC患者hTERC基因扩增的百分比明显高于LSIL、ASC-US和NILM患者(p<0.005);组织学分组中CINⅢ及SCC患者hTERC基因扩增的百分比明显高于CINⅡ及以下的患者(p<0.005)。5、各种异常杂交类型与细胞学结果有关(p<0.05)。在各类异常杂交类型中2-3类型所占的百分比最高,而特殊杂交类型与细胞学结果之间的相关性最大。讨论纤支镜刷检因简便、快捷、经济、实用且准确性高而成为诊断肺癌的重要方法之一。然而,当癌细胞异型性不明显或数量较少时,临床上经常出现高度可疑为肺癌,反复的细胞学检查却是阴性的结果。这可能是由于玻片中的癌细胞被大量的红细胞、坏死碎屑和大量粘液所掩盖。液基细胞学检测的优势是涂片背景干净,红细胞大多破坏消失,粘液丝溶解,炎性细胞数量明显减少,异常细胞显而易见不易漏诊。本研究中对肺癌的诊断由传统涂片法的118例增加到LCT法的146例,敏感性明显高于传统涂片法。本研究中LCT检测小细胞癌敏感性明显高于传统涂片法。这样的结果是因为传统涂片中包含着大量坏死物质,小细胞癌细胞拥挤成群,背景中包含大量粘液、上皮细胞和杂质,癌细胞很难被观察到,因此降低了诊断的敏感性。传统涂片法诊断腺癌18例,而LCT为24例。尽管传统涂片与LCT法的诊断敏感性无统计学差异,但两种方法联合检测的敏感性明显高于传统涂片法。在鳞癌组,联合检测与传统涂片法的敏感性无统计学差异。本研究中LCT法检测的8例鳞癌和1例腺癌中,第一张玻片无癌细胞,而第二张玻片中却检测到了癌细胞。这可能是由于鳞癌细胞的非球状形态在离心时不容易沉降而导致了癌细胞的丢失。这与我们教研室前期工作应用液基法检测痰液中癌细胞的报道一致。一些研究中使用比较基因组杂交方法研究宫颈癌和肺癌染色体的不稳定性,结果发现3q的扩增是癌前病变到宫颈癌和肺癌中的重要事件,并且异常基因多位3q26,而其中最重要的基因是人类端粒酶RNA基因。该基因的扩增可阻止细胞凋亡最终导致肿瘤的发生。人类端粒酶由端粒酶RNA,端粒酶逆转录酶及端粒酶结合蛋白3部分组成。其中端粒酶RNA能以自身为模板,在端粒酶逆转录酶的作用下形成端粒片段,并连接于染色体端粒的末端,避免了由于细胞分裂而引起的染色体末端的丢失,阻止细胞凋亡,使细胞得以永生。人类端粒酶RNA基因位于3q26。hTERC基因的异常扩增被认为是肿瘤形成的早期事件。本研究中肺癌患者hTERC基因的扩增量明显高于良性病变患者,并且在SCC组中检测]hTERC基因的敏感性明显优于LCT法。11例肺癌LCT法诊断结果为可疑癌细胞或异型增生或正常上皮细胞,而FISH结果为阳性。这样的结果提示病变细胞形态学发生改变之前,很可能hTERC基因已发生扩增。检测]hTERC基因的表达既有助于鉴别肺部病变的良恶性,而且对肺癌的早期诊断有重要的临床应用价值。目前宫颈癌的筛查方法多采用宫颈脱落细胞学检查和HPV病毒检测。细胞学检测敏感性相对稍差,因此需要频繁的随访调查。HPV检测敏感性的确很高,但仅仅少部分HPV阳性病变最终会发展到宫颈癌,特别是一些年轻的女性,HPV阳性病人可以自动转阴,因此限制了其在临床使用的有效性。本研究中,hTERC基因的扩增与细胞学与组织学结果有关(p<0.05)。这项检测可以对细胞学结果做以补充,特别是HSIL患者。本研究中细胞学结果和组织学结果均与hTERC基因的扩增呈正相关,病变越重,hTERC基因扩增的百分比越高。在Haddad等人的另一研究中,12例诊断为正常的涂片中,4例已经存在着hTERC基因的扩增。这些人在1-3年后发展为CINⅢ或宫颈癌；10位患者诊断为CINⅠ或CINⅡ。经过数月至2年后,细胞学诊断为正常。结果表明,这些自愈的患者并不存在hTERC基因的扩增。从这个数据上我们可以看到,检测hTERC基因的扩增不仅能够诊断上皮内瘤病变,更重要的是它能够提供个体的潜在病变。同它们的研究结果相似,在我们的研究中,少数HSIL的患者hTERC基因的扩增与一些LSIL、ASC-US和NILM的患者一样低。相反少数LSIL、ASC-US和NILM的患者与一些HSIL的患者hTERC基因的扩增一样高。这就提示我们一些潜在的个体病变：加重或自愈。在未来的研究中,我们将对这样的患者进行随访。此外,我们评估了各种异常的杂交类型以及异常杂交类型与细胞学结果之间的相关性研究。结果表明,各种异常杂交类型与细胞学结果为正相关,其中SHP类型的相关系数最高。SHP类型包括3-4～6,3-8～9,4-5～8,4-10,5-4～7,6～4,6-6～8,7-7,7-9,8-6,8-10类型,这些类型在NILM和ASC-US中几乎看不到,但是在HSIL和SCC中却非常普遍。在SHP类型中3-8,3-9,4-10,5-4,5-7,6-7,7-7,7-9类型仅仅在HSIL和SCC中出现,提示我们这些类型对于诊断HSIL有一定诊断意义。应用FISH技术检测纤支镜刷检和宫颈液基细胞学标本中hTERC基因的扩增优于细胞学诊断,hTERC基因的扩增不仅能够诊断宫颈癌及肺癌,更重要的是它能够提供个体的预后提供参考。结论1、应用LCT法检测小细胞肺癌敏感性优于传统涂片法,二者联合检查敏感性明显优于传统涂片法。2、应用FISH检测纤支镜刷检液基细胞标本中hTERC基因的表达有助于鉴别良恶性病变,并对肺癌的早期诊断具有重要的临床应用价值。3、应用FISH检测宫颈液基细胞标本中hTERC基因的表达,对宫颈癌及癌前病变的诊断具有重要的临床应用价值。