论文部分内容阅读
钙离子作为植物细胞中的第二信使在调节和响应外来非生物胁迫的信号转导中起着重要作用,钙信使产生后通过与钙离子结合蛋白相互作用,从而将信号继续向下游传递。在植物细胞中发现有钙调素、CDPK.CBL等多种钙离子结合蛋白。CBL蛋白作为近年来刚发现的一类钙结合蛋白,它可以通过与一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶-CIPK相互作用而介导钙信号的转导。在拟南芥中对钙信号网络已经进行了深入研究,但是在其它植物特别是在林木植物研究上还未见报道。杨树基因组(毛果杨：Populus trichocarpa)测序的完成,为我们研究CBL-CIPK信号途径提供了良好平台(model).本研究利用毛果杨基因组数据库对胡杨(Populus euphratica)(一种沙漠建群树种)中的CBL-CIPK信号途径进行了系统研究。1.首先利用生物信息学手段,在毛果杨基因组中(毛果杨)鉴定和分离了10个编码CBL蛋白的基因、25个编码CIPK蛋白的基因。通过比较基因组学对毛果杨、拟南芥、水稻CBL和CIPK家族结构、结构域和进化关系做了分析,研究表明在进化过程中这两个家族在成员数量和家族结构上比较保守。但是与拟南芥相比,在毛果杨基因组中有更多的并系同源基因对(paralogous gene pairs),研究发现毛果杨多数同源基因对是通过染色体间的复制和交换产生的。毛果杨染色体间的复制和相互交换事件在该家族基因成员数量扩增过程中起了重要作用。为了进一步研究这两个家族在逆境条件下所起的作用,我们在胡杨中克隆出了10个CBL(PeCBL1-10)基因家族成员,14个CIPK(PeCIPK3α、5、6b、7、9α、11α、12b、14、1 5、16、23α.23b.24a、24b)基因家族成员,并在逆境条件下对10个PeCBL基因成员的表达作了分析。研究发现,PeCBLl,2,3,4,5,9和PeCBL10等7个成员在对外来逆境做出的调控反应中起着重要作用。研究10个CBL基因编码的氨基酸序列发现,它们除了在N端含有一段不太保守的序列之外,在C端都含有4个与钙离子结合的EF手型结构。而N端不保守的序列可能与该蛋白在细胞中的亚细胞定位有关。比较14个PeCIPK的氨基酸序列,发现除了PeCIPK24b,都含有一个典型的丝氨酸／苏氨酸激酶区域,一个与CBL结合的NAF结构域及一个可能与磷酸酶相互作用的PPI结构域。而PeCIPK24b,可能是胡杨长期在高盐胁迫条件下的生境压力造成了激酶区域中一个关键的位点,即结合ATP的赖氨酸位点发生了突变。该位点由赖氨酸突变成了天冬酰胺,其激酶属性完全丧失。2.将PeCBL和PeCIPK分别构建至酵母双杂交载体中(pGBKT7和pGADT7),进行酵母双杂交实验。结果显示,PeCBL 1与PeCIPK3a、5、6b、7、9a、12b、15、16、23a、24a之间有相互作用。PeCBL4与PeCIPK23a、PeCIPK24a之间有相互作用。进一步通过BiFC手段验证胡杨PeCIPK23a、23b、24a、24b与10个胡杨PeCBL之间的相互作用关系发现,PeCIPK23a、23b与所有10个PeCBL之间都有相互作用；PeCIPK24a与PeCBL1、2、3、4、6、7、10之间有相互作用。由于在拟南芥中已经阐明与胡杨PeCIPK23a、24a同源的AtCIPK23、24分别介导低钾和高盐信号转导；所以我们推断,胡杨PeCBL1、PeCBL4可以通过与PeCIPK23a、24a相互作用形成多种不同的组合(complex),各组合之间相互影响、相互关联,与低钾、盐胁迫信号转导密切相关。3.通过转基因手段验证胡杨PeCBL1、PeCBL4、PeCIPK23a、PeCIPK24a在调控低钾、高盐胁迫下的信号转导机制表明,胡杨PeCBL1、PeCIPK23a可以互补拟南芥突变体因AtCBL1、AtCIPK23缺失所造成的对低钾胁迫的敏感性；PeCBL4、PeCIPK24a可以互补拟南芥突变体因AtCBL4、AtCIPK24缺失所造成的对盐胁迫的敏感性。与拟南芥一样,在胡杨细胞中,PeCBL1-PeCIPK23介导低钾胁迫的信号转导;PeCBL4-PeCIPK24介导高盐胁迫的信号转导。另外,我们发现PeCBL1虽然与PeCIPK24a有相互作用但是它们并不直接介导盐胁迫信号转导；PeCBL4与PeCIPK23a有相互作用,但是并不直接介导低钾胁迫的信号转导。4.我们对PeCIPK可能调控的下游一类Shake-like型钾离子通道进行了研究。酵母杂交和BiFC结果表明该家族中与拟南芥AKT1同源的两个成员PeKC1、PeKC2与PeCIPK23a有相互作用。向拟南芥野生型植株和突变体aktl中超量表达PeKCl和PeKC2能大大提高转基因植物对低钾胁迫条件的抗性。以上结果表明胡杨PeCBL1-PeCIPK23是通过磷酸化调控下游一类Shaker-like型钾离子通道PeKC1、PeKC2来实现低钾胁迫信号转导的。5.在毛果杨基因组中鉴定出了13个与真核生物内含子剪切有关的ECT基因。其中6个成员在胡杨中得到了克隆并将其构建至了酵母双杂交载体。该基因家族在拟南芥中发现受CBL-CIPK信号途径的调控。本研究为下一步研究该家族的信号调节及其它具体功能奠定了基础。总之,本研究通过生物信息、酵母杂交、BiFC及转基因等手段在胡杨中鉴定出了调控低钾胁迫的PeCBL 1-PeCIPK23a/b-PeKC 1/2信号途径及PeCBL4-PeCIPK24a调控的盐胁迫信号途径；这两个途径相互影响,共同调节低钾、高盐等胁迫的信号转导。我们的工作为今后进行抗逆相关的分子植物育种提供了重要理论基础。