肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段,早期发现和实时干预是肝纤维化防治的关键。肝穿刺活检是明确肝病病因,评价肝脏的炎症坏死及纤维化程度的金标准,但仍有许多不足之处,如创伤性、取样误差、观察者自身及观察者间偏差等。因此临床上迫切需要寻找简单且易推广的非创伤性诊断方法诊断和评估肝纤维化。目前,针对肝纤维化的非创伤性诊断方法主要包括肝纤维化非创伤性诊断模型和生物标志分子靶向诊断技术,日益成为世界性的研究热点。本研究的目的是通过对各个肝纤维化非创伤性诊断模型的验证和分析比较,评价其诊断价值,为慢性乙型肝炎肝纤维化临床诊断和疗效考核提供依据。同时检测整合素αvβ3在人活化肝星状细胞和慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达,研究整合素αvβ3和肝纤维化之间的关系,探讨以整合素αvβ3作为反映肝纤维化进展的生物标志的可能性。本研究的主要内容分为二部分：慢性乙型肝炎患者肝纤维化无创诊断模型的评价；整合素αvβ3受体在人肝星状细胞的表达及其整合素αvβ3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、CD31在慢性乙型肝炎患者肝纤维化组织中的表达,探讨以整合素αvβ3作为反映肝纤维化进展的生物标志的可能性。第一部分慢性乙型肝炎患者肝纤维化无创诊断模型的评价背景：近年来,国内外提出了一系列肝纤维化非创伤性诊断模型,这些预测模型大多数来自于慢性丙型肝炎肝纤维化,在中国的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中尚未得到有效验证和临床应用。目的：通过对慢性HBV感染患者各个肝纤维化非创伤性诊断模型的验证和分析比较,评价其诊断价值,为慢性乙型肝炎肝纤维化临床诊断和疗效考核提供依据。方法：选取112例慢性HBV感染患者,进行肝组织活检的病理学分期,并检测血清指标,用灵敏度等诊断试验评价指标、受试者工作曲线(ROC)及连续区间似然比等方法评估APRI指数、Forns指数、S指数、APAG指数和Fibroindex等模型的诊断价值。结果：各指标组合模型对肝纤维化程度都具有一定诊断价值,其中APAG模型和S指数模型表现较佳。APAG指数模型判断有无显著性肝纤维化、重度肝纤维化和早期肝硬化时的ROC曲线下面积(AUC)分别达0.858、0.891、0.930,以0.27为界定值排除显著性肝纤维化的敏感性、特异性和阴性预测值分别为98%、24%和92%：以0.8为界定值诊断显著肝纤维化的敏感性、特异性和阳性预测值分别为64%、91%和90%,45.5%患者可被正确预测有无显著性肝纤维化。S指数模型判断有无显著性肝纤维化、重度肝纤维化和早期肝硬化时的ROC曲线下面积(AUC)分别达0.837、0.847、0.866,以0.1为界定值排除显著性肝纤维化的敏感性、特异性和阴性预测值分别为94%、47%和85%：以0.5为界定值诊断显著肝纤维化的敏感性、特异性和阳性预测值分别为59%、91%和90%,52.7%患者可被正确预测有无显著性肝纤维化。用连续区间似然比方法分析发现当APRI指数值≥1.0,则可以基本肯定患者有显著性肝纤维化,当≤0.3则可以基本排除患者有显著性肝纤维化,介于0.3～1.0之间的患者还要进一步通过肝穿刺或其他方法证实。结论：肝纤维化非创伤性诊断模型能较好地区分存在显著性肝纤维化的慢性乙型肝炎患者,其中以APAG模型和S指数模型较为简便有效,可以避免部分患者行肝穿刺检查。应用连续区间似然比方法优化了基于慢性丙型肝炎患者建立的诊断模型,能评价部分处于上下二个界值之间的患者,提高其预测准确性,使更多患者免于肝穿刺及其他检测方法。第二部分整合素αvβ3在人肝星状细胞和慢性乙型肝炎患者肝纤维化组织中的表达背景：HSC增殖及细胞表型转化、ECM合成增多沉积同时伴有新生血管形成是进展性肝纤维化修复重建中突出的病理表现。整合素是一类细胞黏附分子,主要介导细胞与ECM、细胞与细胞间的黏附和细胞内外的信息传递,调节细胞增殖、生长及分化等。整合素αVβ3是多种ECM的受体,主要传递和细胞增殖、分化、运动、分布、定居、生存或凋亡等有关的细胞信号。正常肝组织仅门静脉周围表达少量整合素αVβ3,在肝实质中不表达,HSC活化和血管新生时表达明显上调。在大鼠肝纤维化模型中发现整合素αVβ3表达增加与肝纤维化进展一致,肝纤维化进展中整合素αVβ3表达水平增加与HSC活化和血管新生有关,并与间质重建程度平行。但是在慢性乙型肝炎患者肝纤维化过程中,肝组织中整合素αvβ3的表达及血管新生情况尚不明确。目的：探讨人活化肝星状细胞中整合素αvβ3和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,研究慢性乙型肝炎患者肝组织中整合素αvβ3,α-SMA和CD31在不同肝纤维化分期的表达,探讨以整合素αvβ3作为反映肝纤维化进展的生物标志的可能性。方法：通过体外培养人类活化的肝星状细胞株LX-2,用Western blot方法定量检测人活化HSC中的整合素αvβ3和α-SMA的表达,并用细胞免疫荧光染色观察整合素αvβ3和α-SMA在人活化HSC的表达。112例慢性乙型肝炎患者行肝组织活检,常规苏木精-伊红(HE)染色、Masson及网状纤维染色,并用免疫组织化学染色检测不同肝纤维化分期整合素αvβ3、α-SMA和CD31的表达。结果：免疫荧光染色显示人活化HSC中整合素αvβ3聚集表达于细胞膜和细胞浆,表达部位与伸展的细胞外形一致,α-SMA表达于细胞浆,二者在胞浆中的表达部位相似；从蛋白质表达水平研究发现在人活化HSC中存在整合素αvβ3与α-SMA的表达。随着肝纤维化程度的加重,肝实质中整合素αvβ3、α-SMA和CD31表达范围明显扩大,从汇管区向肝实质深入,在S4期患者扩大的汇管区及纤维间隔中有新生血管形成。肝组织整合素αvβ3、α-SMA和CD31的表达和肝纤维化程度呈正相关(P<0.01),S2-4分期(即有显著性肝纤维化)患者肝组织中的整合素αvβ3、α-SMA和CD31的表达明显高于SO-1分期(即无显著性肝纤维化)的患者(P<0.001)。免疫荧光染色显示肝组织整合素αvβ3和α-SMA两者表达部位基本一致。结论：人HSC中整合素αvβ3的表达与HSC活化有关。慢性乙型肝炎患者肝纤维化进展过程中,整合素αvβ3表达上调与HSC活化和血管新生有关,可用来鉴别有无显著性肝纤维化,从而有可能成为肝纤维化进展的生物标志。