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目的:
极光激酶A(AURKA)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员,已被证实是多种肿瘤发生和发展的关键驱动基因。本研究的目的是探究AURKA在儿童肝母细胞瘤(HB)的表达及其与临床特征的相关性,以及AURKA抑制剂alisertib(ALS)对人肝母细胞瘤HuH-6细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其机制。
方法:
1.收集重庆医科大学儿童医院2015-2018年33例未经化疗的人肝母细胞瘤组织切片,其中14例切片有瘤旁正常肝组织,并收集所有病例的临床资料。采用免疫组织化学法(IHC)检测肝母细胞瘤组织及瘤旁正常肝组织中AURKA的表达。然后,统计分析AURKA表达与HB的临床病理特征之间的关系。
2.HuH-6细胞转染NC-siRNA或AURKA-siRNA后,使用Westernblot检查敲减效率,CCK-8检测敲减AURKA对HuH-6细胞活力的影响。
3.使用CCK-8,EdU,流式细胞术,Westernblot检测ALS对HuH-6细胞周期、增殖及周期相关蛋白Cyclin-D1表达的影响。
4.采用流式细胞术、TEM、Westernblot检测ALS对HuH-6细胞凋亡、自噬及凋亡自噬相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL、cleavedcaspase-3和LC3-II表达的影响。
5.使用CCK-8、流式细胞术、Westernblot检测自噬抑制剂3-MA联合ALS对HuH-6细胞活力、凋亡和LC3II表达的影响。
6.用Westernblot检测ALS对HuH-6细胞p-AURKA、p38MAPK和p-p38MAPK表达的影响。
结果:
1.免疫组化染色结果显示33例HB组织中,23例呈AURKA高表达;而14例瘤旁正常肝组织中仅有1例高表达AURKA。AURKA在HB组织的表达显著高于瘤旁组织(63.34%vs7.14%,p<0.001)。统计学分析结果显示AURKA高表达与HB的儿童肿瘤学组(COG)分期和肿瘤转移相关。
2.Westernblot检测结果表明AURKA-siRNA组与NC-siRNA组相比,AURKA表达显著下调;而Control组与NC-siRNA组之间AURKA表达无显著差异。CCK-8检测结果显示与NC-siRNA组相比,转染AURKA-siRNA48h或72h后HuH-6细胞活力显著下降。
3.EdU和CCK-8检测结果表明ALS显著抑制了HuH-6细胞增殖活性。流式细胞术结果表明ALS诱导了HuH-6细胞G1期阻滞。Westernblot结果表明ALS呈浓度依赖性显著下调了HuH-6细胞Cyclin-D1的表达。
4.流式细胞术结果表明ALS显著促进了HuH-6细胞凋亡。TEM结果表明与Control组相比,ALS组HuH-6细胞的自噬体数量增加。Westernblot结果表明ALS显著下调了HuH-6细胞Bcl-2和Bcl-xL的表达并上调了cleavedcaspase-3和LC3II的表达。
5.Westernblot结果表明3-MA+ALS组与ALS组相比,HuH-6细胞的LC3II表达显著下调;而3-MA组与Control组相比,HuH-6细胞的LC3II表达无显著差异。CCK-8结果表明3-MA+ALS组与ALS组相比,HuH-6细胞活力显著下降;而3-MA组与Control组相比,细胞活力无显著差异。流式细胞术结果表明3-MA+ALS组与ALS组相比,HuH-6细胞凋亡率显著上升。
6.Westernblot结果表明ALS显著抑制了HuH-6细胞p-AURKA的表达以及p38MAPK磷酸化。
总结:
AURKA在人HB组织中的表达显著高于瘤旁正常肝组织,同时AURKA高表达与HB的COG分期和肿瘤转移相关。在体外实验中,敲减AURKA显著抑制了HuH-6细胞活力,提示AURKA是一个潜在的肿瘤预后标志和治疗靶点。AURKA特异性抑制剂ALS可抑制HuH-6细胞增殖并促进细胞凋亡和自噬;而使用3-MA抑制ALS诱导的细胞自噬后,细胞凋亡率进一步提高。此外,ALS可抑制p-38MAPK磷酸化。上述结果表明ALS是一种潜在的HB靶向治疗药物,其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路活性有关。
极光激酶A(AURKA)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员,已被证实是多种肿瘤发生和发展的关键驱动基因。本研究的目的是探究AURKA在儿童肝母细胞瘤(HB)的表达及其与临床特征的相关性,以及AURKA抑制剂alisertib(ALS)对人肝母细胞瘤HuH-6细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其机制。
方法:
1.收集重庆医科大学儿童医院2015-2018年33例未经化疗的人肝母细胞瘤组织切片,其中14例切片有瘤旁正常肝组织,并收集所有病例的临床资料。采用免疫组织化学法(IHC)检测肝母细胞瘤组织及瘤旁正常肝组织中AURKA的表达。然后,统计分析AURKA表达与HB的临床病理特征之间的关系。
2.HuH-6细胞转染NC-siRNA或AURKA-siRNA后,使用Westernblot检查敲减效率,CCK-8检测敲减AURKA对HuH-6细胞活力的影响。
3.使用CCK-8,EdU,流式细胞术,Westernblot检测ALS对HuH-6细胞周期、增殖及周期相关蛋白Cyclin-D1表达的影响。
4.采用流式细胞术、TEM、Westernblot检测ALS对HuH-6细胞凋亡、自噬及凋亡自噬相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL、cleavedcaspase-3和LC3-II表达的影响。
5.使用CCK-8、流式细胞术、Westernblot检测自噬抑制剂3-MA联合ALS对HuH-6细胞活力、凋亡和LC3II表达的影响。
6.用Westernblot检测ALS对HuH-6细胞p-AURKA、p38MAPK和p-p38MAPK表达的影响。
结果:
1.免疫组化染色结果显示33例HB组织中,23例呈AURKA高表达;而14例瘤旁正常肝组织中仅有1例高表达AURKA。AURKA在HB组织的表达显著高于瘤旁组织(63.34%vs7.14%,p<0.001)。统计学分析结果显示AURKA高表达与HB的儿童肿瘤学组(COG)分期和肿瘤转移相关。
2.Westernblot检测结果表明AURKA-siRNA组与NC-siRNA组相比,AURKA表达显著下调;而Control组与NC-siRNA组之间AURKA表达无显著差异。CCK-8检测结果显示与NC-siRNA组相比,转染AURKA-siRNA48h或72h后HuH-6细胞活力显著下降。
3.EdU和CCK-8检测结果表明ALS显著抑制了HuH-6细胞增殖活性。流式细胞术结果表明ALS诱导了HuH-6细胞G1期阻滞。Westernblot结果表明ALS呈浓度依赖性显著下调了HuH-6细胞Cyclin-D1的表达。
4.流式细胞术结果表明ALS显著促进了HuH-6细胞凋亡。TEM结果表明与Control组相比,ALS组HuH-6细胞的自噬体数量增加。Westernblot结果表明ALS显著下调了HuH-6细胞Bcl-2和Bcl-xL的表达并上调了cleavedcaspase-3和LC3II的表达。
5.Westernblot结果表明3-MA+ALS组与ALS组相比,HuH-6细胞的LC3II表达显著下调;而3-MA组与Control组相比,HuH-6细胞的LC3II表达无显著差异。CCK-8结果表明3-MA+ALS组与ALS组相比,HuH-6细胞活力显著下降;而3-MA组与Control组相比,细胞活力无显著差异。流式细胞术结果表明3-MA+ALS组与ALS组相比,HuH-6细胞凋亡率显著上升。
6.Westernblot结果表明ALS显著抑制了HuH-6细胞p-AURKA的表达以及p38MAPK磷酸化。
总结:
AURKA在人HB组织中的表达显著高于瘤旁正常肝组织,同时AURKA高表达与HB的COG分期和肿瘤转移相关。在体外实验中,敲减AURKA显著抑制了HuH-6细胞活力,提示AURKA是一个潜在的肿瘤预后标志和治疗靶点。AURKA特异性抑制剂ALS可抑制HuH-6细胞增殖并促进细胞凋亡和自噬;而使用3-MA抑制ALS诱导的细胞自噬后,细胞凋亡率进一步提高。此外,ALS可抑制p-38MAPK磷酸化。上述结果表明ALS是一种潜在的HB靶向治疗药物,其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路活性有关。