杨树PtrMYB57负调控花青素和单宁合成的分子机制研究

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花青素和单宁这两种类黄酮化合物是植物体内十分重要的次生代谢产物,在帮助植物体抵御生物或非生物胁迫方面具有不可替代的作用。因此,花青素和单宁的生物合成的分子机制的研究,对于植物次生代谢产物的利用及生产上都具有极其重要作用。  现已经了解到MYB家族的转录因子在花青素、单宁合成代谢中扮演了极其重要的作用,它们被认为直接抑或是间接地控制了植物体内花青素和单宁的积累。  通过生物信息学分析,本论文从毛果杨(P.trichocarpa)中筛选出一个可能参与花青素、单宁合成的MYB转录因子:PtrMYB57。为阐明其在花青素、单宁合成过程中的功能,在克隆PtrMYB57基因的基础上,进行了一系列研究,最终证明PtrMYB57准录因子在杨树中负调控花青素、单宁的代谢合成途径。具体研究如下:  1、PtrMYB57基因的克隆并构相应载体,用于转化杨树、烟草等植物材料和酵母菌株,得到转基因阳性株系。  2、PtrMYB57在野生型杨树中的组织表达谱分析和该基因的启动子分析都证实其在成熟叶片中表达量较高。  3、亚细胞定位实验显示PtrMYB57蛋白主要集中在植物细胞核内。酵母单杂交的实验说明转录因子PtrMYB57是一种具有抑制作用的转录因子。  4、对野生型和转基因杨树的表型观察和化学成分检测发现PtrMYB57有效地抑制了杨树叶片中花青素和单宁的合成和异位沉积。  5、荧光定量PCR检测结果表明,PtrMYB57抑制了花青素和单宁合成途径中关键酶基因的表达。  6、通过构建LxLxL结构域突变体Ptr△MYB57并进行瞬时转化实验发现:LxLxL结构域是PtrMYB57基因的抑制元件。  7、在瞬时转化实验中,PtrMYB57与bHLH131、TTG1共转其抑制作用明显增强。通过酵母双杂交实验得到,PtrMYB57与bHLH131存在直接的相互作用,而且bHLH131作为桥梁联系PtrMYB57与TTG1,三者构成MBW复合体,进而发挥功能。  通过上述的植物分子遗传和生化分析实验,证明了PtrMYB57参与了杨树中花青素和单宁合成的调控,并阐明了其蛋白通过与bHLHI31、PtrTTG1结合构成MBW复合体,降低了关键酶基因的表达,进而抑制了杨树中花青素和单宁的积累。上述结果为此后继续深入研究植物体内调控花青素和单宁合成的分子机制提供了参考,还为未来开发利用相关林业资源奠定了基础。
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