一研究背景随着人民生活水平的提高以及人口老龄化进展的加快,近20年来我国心脑血管疾病发病率与死亡率逐年升高。冠心病(CAD)是由冠状动脉粥样硬化引起的心肌缺血性疾病,动脉粥样硬化(AS)是CAD的病理基础,脂质浸润学说贯穿了AS的形成、进展及恶化,并与其他学说密切相关,血脂异常是AS发生和发展的最重要因素之一。大量流行病学资料显示,AS的严重程度随血清胆固醇水平的升高呈正相关,血清胆固醇的浓度与冠心病的死亡率呈正相关。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高导致的血脂异常是AS病理改变基础之一,AS,的严重程度与LDL-C水平的升高呈线性加重,LDL-C水平与各种心脑血管事件的发生率呈正相关。临床治疗上,我们采用他汀类等药物降低LDL-C水平,可显著减少心脑血管疾病的发生,降低LDL-C能让病人在临床治疗中获益。但是,尽管LDL-C水平达到指南要求甚至低于指南要求,但患者心脑血管事件发生率也只能降低30%左右,依然残留70%左右心血管事件发生率无法避免。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是另外一种重要的脂蛋白,HDL具有心血管保护作用,大量流行病学资料表明,血清HDL-C浓度与CAD发病危险呈独立的负相关；Framingham研究发现,血清HDL-C<35mg/dl者的CAD死亡率为血清HDL>55mg/dl者的4.1倍；血清HDL-C水平每升高1mg/d1,男性患者CAD的危险性即降低2%,女性降低3%。以上结果均提示,HDL是AS的保护因素之一,升高HDL-C水平是抗AS的靶点之一。HDL通过多种机制发挥抗AS的功效,包括对逆胆固醇转运(Reverse Cholesterol Transport, RCT)、抗氧化、抗炎、改善内皮细胞功能失调、抗血栓及促纤溶等。然而,越来越多的研究发现升高HDL-C水平并未达到人们预期的效果,CETP抑制剂torcetrapib尽管大幅度升高HDL-C水平,但torcetrapib组的全因死亡人数较阿托伐他汀组多,该研究不得不提前终止。Gomarasch等发现在载脂蛋白AI(ApoA-I)转变为ApoA-I Milano人群中,HDL-C的水平低,但其CAD的发生率也低且明显长寿。肝脏清道夫受体BI(SR-BI)高度表达小鼠,虽然降低了HDL-C水平,却具有显著的抗AS功能。因此HDL-C与AS的关系比我们想像中更加复杂,我们临床工作者及科研人员应重新审视HDL-C水平的意义,不单单需要关注HDL-C的水平,更需要关注HDL的功能对AS的影响。正常HDL功能的HDL才能发挥抗AS作用,而功能异常的HDL甚至有促AS进展的作用。HDL的多面性,与其结构复杂密切相关,HDL包含着多种酶和脂蛋白,其代谢途径也受多种酶的影响,其中任何一个脂蛋白性质的改变、酶的活性或者量的改变均能影响HDL的正常功能。RCT是HDL抗AS的重要的功能之一,RCT是一个复杂的过程,外周组织(包括动脉壁)游离胆固醇在多种酶的作用下与血清中ApoA-I结合后逐渐成为成熟的富含胆固醇的大颗粒HDL,其与肝脏SR-BI受体结合并被肝脏获取,最后HDL内的胆固醇通过肝细胞代谢,最终经胆汁排泄,从而使集聚在血管内皮下胆固醇排泄至体外,达到缓解甚至逆转AS的作用。RCT足由多种酶、多种受体、多种脂蛋白共同参与的复杂过程,ApoA-I,LCAT和CETP这两个酶在RCT过程中起着极其重要。抗炎抗氧化功能是HDL的另一个重要的功能。正常功能的HDL颗粒具有强大的抗氧化能力,一方面HDL含有多种抗炎抗氧化酶(如：PON1、ApoA-I),可以中和已形成的Ox-LDL的毒性反应；另一方面,HDL可以抑制氧化因子和炎症因子(如：MPO、LPO、SOD)的毒性作用,减少机体的炎症瀑布链反应,从而延缓AS的进展。正常情况下,ROS的产生和清除保持平衡状态,在动脉粥样硬化情况下,氧化产物生成大于抗氧化能力产生氧化应激,将导致血管的持续损伤,从而加剧动脉粥样硬化进展。功能异常的HDL容易形成Ox-HDL,而被氧化形成的Ox-HDL不单不具有抗氧化的能力,甚至促进Ox-LDL的形成。内皮的保护作用是HDL一个重要的功能。一方面HDL抑制单核细胞粘附和迁移到血管壁,刺激内皮细胞修复和增殖,抑制生长因子诱导的血管平滑肌细胞的增生；另一方面,HDL可以促进NOS催化内皮细胞内L-精氨酸产生,促进内皮细胞生成NO；升高血管内皮功能,还可以抑制血小板和白细胞在受损内膜的聚集和粘附,防止内皮功能受损。HDL可以通过多种途径促进eNOS的表达,减少抑制eNOS生成的因素,起到保护内皮功能的作用。脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是新近发现的与动脉粥样硬化密切相关,可将Ox-LDL水解成大量的溶血卵磷脂和游离氧化脂肪酸,这些促进动脉粥样硬化作用产物进一步活化粒细胞和Lp-PLA2,正常功能的HDL能结合Lp-PLA2,减少机体游离Lp-PLA2量,从而减少血栓的形成。Hcy升高同样也会引起多种疾病的发生,尤其增加心脑血管事件的发生的风险。同型半胱氨酸的合成和代谢保持着动态平衡,Hcy高于15.0μmol/L称为高同型半胱氨酸血症(hyperhomocy steinemia,高Hcy)。Hhcy是除高血压、高脂血症、吸烟、肥胖、心脑血管病家族史的一个新的独立的AS的危险因素,并且Hcy水平和血管危险之间呈正性相关关系。血浆Hcy每升高5μmol/L,缺血性心脏病发生率增加32%,卒中发生率增加59%,血浆Hcy每降低3μmol/L,可使缺血性心脏病风险降低11-20%,脑卒中风险降低15-33%。血浆总Hcy水平每升高5μmol/L则冠心病危险性男性增加60%,女性增加80%,相对危险性男性为1.6,女性为1.8,相当于总胆固醇每升高20mg/dL的危险性,因此高Hcy是冠心病的一个独立危险因素。脂质学说是动脉硬化的基础,目前国内外对Hcy与脂质学说的关系的研究主要集中在：1、Hey可以影响脂质代谢,使LDL代谢减慢,最终导致机体LDL-C水平的升高。2、Hey致LDL-C沉积作用,Hey可作用于低密度脂蛋白导致其载脂蛋白B的游离氨基巯基化,形成Hey与LDL复合物,这种被巯基化修饰的LDL可以不受负反馈抑制被巨噬细胞吞噬,胞内降解增加,引起胞内胆固醇堆积。3、Hcy致脂质氧化致炎作用：Hcy含自由巯基,可以自身氧化成Hcy混合性二硫化物和Hcy硫内酯,同时产生大量过氧化物,引起蛋白质损伤,清除氧自由基的酶活性降低,使得细胞和组织发生炎症反应,同时产生大量的Ox-LDL,加剧AS进展。HDL是心血管的保护因素之一,但其与Hcy的关系目前尚无明确的定论。Barter对近年HDL与HCY的关系进行综述发现,既有研究认为Hcy能影响HDL的功能,又有部分研究发现Hcy不影响HDL的功能。然而,越来越多的研究发现,Hcy可以通过影响HDL的某些酶的活性而影响HDL的功能,HCY通过影响PON1酶的活性,而影响HDL抗炎抗氧化功能。Clifford研究发现,HCY与CETP酶的活性密切相关,Hcy浓度升高可以影响CETP酶的浓度,而CETP是HDL代谢过程中的重要酶之一。然而HDL功能包括RCT功能、抗炎、抗氧化、维持细胞内皮稳定等功能,PON1和CETP仅仅是HDL众多功能酶中的一个,因此PON1活性和CETP酶并不能反映HDL的整体功能。Hcy通过影响PON1活性和CETP而调节HDL功能仅是其作用靶点之一,高Hcy可能通过更多的机制影响HDL功能。二研究目的本研究通过研究探讨Hcy和MTHFR基因与正常HDL-C患者冠状动脉硬化的关系,探讨Hcy与冠心病患者冠脉病变程度的相关性。通过检测高Hcy患者和对照组患者(两组患者HDL水平均在正常范围)HDL颗粒中的Apo-AI,LCAf、 CETP酶的含量,探讨高Hcy对HDL的RCT功能的影响。通过检测HDL颗粒中PON1、MPO活性,Lp-PLA2、LPO、SOD和eNOS水平,探讨高Hcy对HDL抗炎抗氧化能力的影响,从而为预防和治疗冠状动脉粥样硬化提供新靶点。三实验方法1.1研究患者入选标准、分组和排除标准本研究随机入选2011年1月～2012年6月佛山市顺德第一人民医院住院患者123例,入选患者全部采集吸烟史、高血压病史、糖尿病史、冠心病家族史和其他既往病史。根据根据美国心脏协会(AHA)推荐,正常空腹血浆同型半胱氨酸水平高于15.0μmol/L,则可诊断为高同型半胱氨酸血症,根据是否存在Hcy升高分为正常对照组和高Hcy组。两组入选人群的HDL-C均正常范围(1.16μmmol/L<HDL-C<1.55μmmol/L)。所有患者均签署知情同意书,如未取得知情同意,退出实验。排除标准：1、慢性肾功能不全患者、接受肾脏移植的患者；2、甲状腺功能亢进或甲状腺功能低下；3、肝功能受损或者既往存在肝脏病变患者；4、恶性贫血、急性白血病、癌症;5、目前或近期正口服甲氨蝶呤、茶碱、B族维生素及叶酸患者。根据入选标准、排除标准、符合HDL-C水平和是否签署知情同意书,有33例患者未纳入研究,共90例患者入选该研究,其中对照组35例,高HCY组55例。1.2血样的采集、保存和生化指标测定早晨8：00前抽取受试者空腹静脉血,部分静置离心放-80℃保存。部分血清及全血立即送顺德第一人民医院检验科用日立7600-210ISE型全自动生化分析仪测定测定：TC、TG、HDL-C、LDL-C、Apo-AI、Apo-B、FBS、PBS、Cr、 BUN、hs-CRP。1.3血浆Hcy的测定采用Agilent1100液相色谱仪,分别由不同的两人在同一天来测定,准确性和重复性均符合要求。批内变异为3.7%,批间变异为4.1%；质控样品测定结果偏差低水平点小于20%,中、高水平点测定结果偏差小于15%；样本两次测定值误差不超过15%；如果误差大于15%则重新测定,直到误差小于15%。1.5MTHFR基因型测定抽提空腹静脉血离心后得到的白细胞中的基因组DNA后,MTHFR C677T多态性位点基因型检测采用PCR-RFLP方法检测MTHFR基因分型,再通过2%琼脂糖凝胶电泳分开得到不同长度的片段。1.6冠脉病变情况所有患者均利用Philip H3000造影机进行冠状动脉造影采集影像,冠脉病变情况由2位专科医师仔细分析,意见有不一致时由第3人核实确定。按病变累及左前降支,左回旋支与右冠状动脉的支数,分为单支,双支和多支病变组；根据美国心脏协会规定的冠状动脉血管图像记录分段评价标准,采用Gensini积分系统对各支血管病变程度进行定量评定。1.7高密度脂蛋白的分离采用密度梯度离心法分离高密度脂蛋白,BCA法测定其浓度。1.8HDL逆转运酶的检测采用酶联免疫吸附剂盒测定HDL颗粒中的LCAT和CETP酶的量。1.9HDL抗炎抗氧化功能的测定采用酶联免疫吸附剂盒测定HDL颗粒中的eNOS和Lp-PLA2酶的量。采用分光光度计法测定PON1、MPO酶的活性和LPO、SOD的量。1.10统计学分析所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,计量资料采用两样本t检验,计量等级资料采用两独立样本秩和检验,计数资料采用例(%)表示,采用卡方检验,最后进行两等级变量间的Spearman相关性分析、两计数资料进行Pearson相关性分析和多元线性回归方法；P≤0.05为差异有统计学意义。四结果人口学特点比较与对照组相比(12.4±1.58mmol/L),高Hcy组(18.99±2.71mmol/L)患者的血清Hcy浓度明显升高(P=0.000),差异具有统计学意义。比较对照组和高Hcy组患者的年龄(χ2=0.407,P=0.685)、性别分布情况(χ2=0.003,P=0.959)、高血压患者(χ2=0.421,P=0.517)、糖尿病患者(χ2=0.778,P=0.378),吸烟患者(χ2=1.014,P=0.314)差异无统计学意义。两组患者的实验室指标比较比较对照组和高Hcy组患者的TC(t=0.534,P=0.595)、TG(t=0.457,P=0.649)、HDL-C (t=1.347, P=0.181)、LDL-C (t=0.650, P=0.517)、Apo-B (t=1.426,P=0.147)、空腹血糖(t=0.687,P=0.494)、餐后2h血糖(t=0.484,P=0.630)、Cr(t=0.301,P=0.764)、BUN(t=0.443,P=0.659)、ALT(t=0.716,P=0.476)、AST(t=1.725,P=0.088)间差异无统计学意义。入选两组患者生化指标情况一致,具有可比性。两组患者冠心病冠脉造影结果的比较对照组相冠脉多数无明显狭窄,或以单支病变为主,而高Hcy组患者冠脉病变程度严重,以单支和双支病变为主,对两组患者进行卡方检验发现,两组患者冠脉病变情况有差异,同时差异具有统计学意义(χ2=17.731,P=0.000)。再进行冠脉评分发现,高Hcy组患者冠脉积分情况较对照组升高,差异具有统计学意义(t=4.222,P=0.000)。两组患者MTHFR基因分型比较与对照组MTHFR基因分型以纯合型为主相比,高Hcy组患者MTHFR基因分型以杂合型的CT型为主,同时存在纯变异型TT型2例,进行卡方检验发现,两组患者分型有差异,同时差异具有统计学意义(χ2=7.463,P=0.024)。MTHFR基因分型与血浆Hcy水平及冠脉病变严重程度相关性分析血浆Hcy水平与MTHFR基因分型呈正相关(r=0.258,P=0.014),但相关关系并不密切。冠脉病变程度(r=0.600,P=0.000)和冠脉积分(r=0.621,P=0.000)与MTHFR基因分型呈正相关。Hcy水平与冠脉积分存在正相关(r=0.641,P=0.000)；Hcy水平与冠脉病变程度也呈正相关(r=0.438,P=0.000),但相关关系并不密切。最后,我们对冠脉积分与其他指标进行多元线性回归分析,以冠脉积分为因变量,其他变量为自变量,模型纳入MTHFR分型基因、HCY、TC、 Apo-AI水平模型有统计学意义(F=45.923,P=0.000)。MTHFR基因分型(t=7.851,P=0.000), HCY(t=5.805, P=0.000)、TC (t=2.748, P=0.007)、Apo-AI (t=-2.253,P=0.027)水平对冠脉积分有显著影响,差异具有统计学意义。高Hcy对Apo-AI的影响与对照组比较(1.27±0.12mmol/L),高Hcy组患者Apo-AI明显降低(1.21±0.13mmol/L)显著降低,差异均有统计学意义(t=2.28,P=0.025)。高Hcy对LCAT酶的影响与对照组比较(1029.02±133.88U/mg),高Hcy组患者LCAT酶(913.20±117.42U/mg)显著降低,差异均有统计学意义(t=4.318,P=0.000)。高Hcy对CETP酶的影响我们对HDL的重要代谢酶CETP检测发现,高Hcy组(26.33±4.13ug/mg)患者CETP酶比对照组(34.70±4.72ug/mg)明显降低,差异均有统计学意义(t=8.854,P=0.000)。高Hcy对PON1的影响与对照组比较(450.55±48.55U/ml),高Hcy组患者PON1活性明显降低(206.48±75.02U/ml)显著降低,差异均有统计学意义(t=17.087,P=0.000)。高Hcy对MPO酶的影响我们对MPO活性检测发现,高Hcy组(5.02+2.02U/L)患者MPO活性比对照组(3.15±1.49U/L)明显升高,差异均有统计学意义(t=4.737,P=0.000)。高Hcy对Lp-PLA2酶的影响与对照组比较(37.35±8.85ng/mg),高Hcy组患者Lp-PLA2酶明显降低(31.80±6.91ng/mg)显著降低,差异均有统计学意义(t=3.326,P=0.001)。高Hcy对LPO酶的影响与对照组比较(0.82±0.09umol/gprot),高Hcy组患者LPO量明显降低(0.93±0.9umol/gprot)显著升高,差异均有统计学意义(t=5.583,P=0.000)。高Hcy对SOD和eNOS的影响与对照组比较(190.32±44.57U/m1),高Hcy组患者SOD活性(204.30±49.37U/ml)升高,但差异无统计学意义(t=1.360,P=0.177)。我们再对eNOS活性检测发现,高Hcy组(5.02±2.02ug/mg)患者eNOS活性比对照组(3.15±1.49ug/mg)升高,但两者差异均无统计学意义(t=1.338,P=0.184)。五结论1.高Hcy组患者冠脉病变程度严重,冠脉积分情况较对照组升高,Hcy水平与冠脉积分存在正相关,提示高Hcy可能是冠心病的一独立危险因素。2.高Hcy组患者MTHFR基因分型以杂合型的CT型为主,同时存在少量纯变异型TT型；冠脉病变程度和冠脉积分呈与MTHFR基因分型呈正相关。3.高Hey可能通过降低HDL颗粒中Apo-AI量,降低LCAT、CETP酶量抑制HDL的RCT功能,促进动脉粥样硬化的进展。4.高Hcy通过降低PON1活性,减少HDL颗粒中Lp-PLA2量抑制HDL的抗炎抗氧化能力,促进动脉粥样硬化的进展。5.高Hcy通过升高MPO活性,增加HDL颗粒中LPO量而降低HDL的抗炎抗氧化功能,从而促进动脉粥样硬化的进展。6.高Hcy并不影响HDL颗粒中SOD和eNOS水平,该结果尚需进一步探讨。7.综上所述,高Hcy组患者冠脉病变程度严重,Hcy水平与冠脉积分呈正相关,提示高Hcy可能是冠心病的一独立危险因素,机制可能与Hcy患者HDL抗AS功能减弱(失功能)有关：高Hcy患者HDL颗粒中Apo-AI、 LCAT、CETP含量减少,抗炎抗氧化功能减弱,导致HDL的功能下降,促进动脉粥样硬化的进展。降低血浆Hey水平,可能改善HDL的功能,降低Hcy可能成为治疗动脉粥样硬化的靶点之一。