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安莎霉素是以AHBA为独特起始单元的一类特殊Ⅰ型聚酮类天然产物,具有良好的生物活性。为更好地认识、改造和应用这一类天然产物,本实验室一直致力于安莎霉素生物合成和新颖安莎霉素发掘工作。目前,安莎霉素的合成途径已基本阐明,但还有若干问题悬而未决,如聚酮链的释放机制和萘安莎的萘环形成机制。本论文工作则分为安莎霉素释放机制验证和新安莎霉素发掘两个部分。 体内敲除实验显示安莎霉素利用酰胺合酶释放聚酮链,但该释放机制并没有得到体外实验的确证。本实验意图通过蛋白质异源表达和X-ray衍射的方法探究酰胺合酶的三维结构,为其释放功能提供证据。实验共计异源表达了15种酰胺合酶,可溶且产量较高的有10种。利用镍柱亲和层析、阴离子交换柱层析和凝胶层析纯化10种酰胺合酶,并进行结晶条件的筛选与优化,最终成功获得了小单孢菌Micromonosporasp.160111中酰胺合酶的晶体结构。分析酰胺合酶160111AS的结构,并与同属于NAT蛋白家族的蛋白进行对比,发现酰胺合酶的结构特点与其功能相适应,从结构生物学的角度为酰胺合酶的释放功能提供了佐证。为进一步进行确证,酰胺合酶160111AS与天然底物类似物的共结晶实验以及RifF等其他酰胺合酶的结晶还要继续进行。 为发掘新的安莎霉素类化合物,本实验室用AHBA合酶基因的简并引物进行PCR,从土壤中筛选AHBA合酶基因阳性菌株。阳性菌Streptomycessp.XZQH13的基因组中有一沉默的安莎霉素合成基因簇ansp。本实验在Streptomycessp.XZQH13中组成型表达了ansp基因簇中的LAL家族正调控基因,成功激活了该基因簇。分离纯化并用MS和NMR鉴定ansp基因簇的主要产物,得到两种已知的安莎三烯类化合物thiazinotrienomycinG和hydroxymycotrieninsA。这是首个通过LAL基因的组成型表达激活安莎霉素合成基因簇的实验。另一株阳性菌Streptomycessp.XZYN4中含有两个含AHBA合酶基因的沉默基因簇rify和nay。依据基因簇序列推断,rify基因簇可能合成甲基化修饰的新颖利福霉素衍生物,nay基因簇的产物则为带有AHBA的未知化合物。为激活rify和nay,本实验尝试了代谢谱比较、调控因子组成型表达与敲除、稀土元素发酵及黑色素指示法等基因簇激活策略。目前尚未成功激活两个基因簇,下一步计划以黑色素指示法为基础,展开多种基因簇激活策略的高通量筛选。 综上所述,本论文工作包括:1)酰胺合酶的结构解析,首次获得了酰胺合酶的三维结构,从蛋白质结构角度初步证明了酰胺合酶的释放功能。。2)两株链霉菌中含AHBA基因的天然产物挖掘。成功激活了链霉菌XZQH13中的安莎三烯合成基因簇,而链霉菌XZYN4中两个基因簇的激活工作仍未完成。酰胺合酶的结构解析最终目的在于阐明安莎霉素的释放机制,而新颖安莎类化合物的发掘也有助于发现和探究新的安莎霉素合成途径,增进人们对安莎霉素生物合成途径的认识。这将为今后改造或构建安莎霉素合成途径,生产人工设计的安莎霉素类化合物打下基础。