新蚜虫疠霉（Pandora neoaphidis）属虫霉目（Entomophthorales）真菌,是蚜虫的专性病原真菌,能够引起寄主高强度的流行病而达到对蚜虫的有效控制,是重要的科学研究对象。前期研究发现并证实了新蚜虫疠霉真菌体内含有内共生菌,本研究以新蚜虫疠霉真菌F98028菌株和醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus ATCC23055菌株为研究对象开展真菌共生细菌及它们之间的互作研究。主要实验结果如下:一、虫霉目病原真菌孢子户外分离器的设计和应用。为了更好地验证新蚜虫疠霉共生细菌的广泛存在,本章中设计并制作出一种户外简易虫霉目真菌孢子分离器装置,并对其分生孢子的收集能力和污染率进行了评价。通过对新型分离器与传统冻存管法对弹射的分生孢子收集的数量进行统计分析,结果发现从开始收集的第三天起,分离器中收集的孢子数明显多于冻存管的,且五天累积孢子总数分离器法多于冻存管法;在统计分析其无污染率后发现传统洁净环境下的培养皿分离法（78±17%）与新型分离器法（76±18%）（t=0.43,P=0.67）无显著性差异,即分离器能够替代传统分离法的超净工作台进行无菌分离。同时因分离器小巧不占空间易于携带、结构简单、操作简便故能够在野外田间实时处理感病蚜虫分离虫霉目真菌,分离器的发明为虫霉目真菌的分离提供了设备支撑。二、醋酸钙不动杆菌遗传转化体系构建。通过将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到大肠杆菌（Escherichia coli）-醋酸钙不动杆菌A.calcoaceticus穿梭质粒pWH1266上构建出质粒pMU125;利用电转化法电转NaOH-乙醇法制备的感受态细胞;通过正交实验设计筛选菌的生长状态（OD600）、电场强度（kv/cm）、电阻（Ohms）和DNA量（ng）四个参数,获得最佳电转化条件即细菌中间生长期（OD600=0.5）、最低电场强度（1.2kv/cm）、中间电阻（200 Ohms）和最大质粒量（700ng）。三、新蚜虫疠霉真菌共生细菌科赫氏法则验证。首先,通过在形成物理隔绝的凹槽里共培养新蚜虫疠霉和共生细菌,利用新蚜虫疠霉孢子弹射的独特生物学特性,对凹槽外真菌菌丝（由弹射的分生孢子生长而形成）进行细菌液体培养,阴性结果可以排除细菌附着在真菌孢子表面随孢子弹射到凹槽外这一可能;其次,提取凹槽外新蚜虫疠霉菌丝总DNA,用醋酸钙不动杆菌特异性引物进行PCR和电泳,电泳图显示出不动杆菌特异性条带,说明醋酸钙不动杆菌能经真菌体表进入真菌体内;再次,通过对比凹槽外真菌菌丝和醋酸钙不动杆菌的透射电子显微镜切片,结果发现凹槽外真菌菌丝内有醋酸钙不动杆菌存在;而且对凹槽外真菌菌丝进行机械破壁处理后,能够分离得到共培养的醋酸钙不动杆菌,通过以上流程,完整地通过了共生细菌的科赫氏法则验证。四、新蚜虫疠霉真菌共生细菌来源初探。首先,通过采集桃蚜Myzus persicae饲喂周期中各饲喂时间点蜜露,并将蜜露涂布在LB固体培养基上,记录产生的菌落数量,构建出桃蚜肠道菌群数量动态变化的折线图,结果显示利福平和四环素的联合使用一定程度上实现了对桃蚜肠道菌群的脱共生;饲喂的醋酸钙不动杆菌在第3天后能在蜜露中检测到,说明经取食的醋酸钙不动杆菌可以在蚜虫的体内存活且整个饲喂周期中蚜虫的生长状况良好即完成了桃蚜取食醋酸钙不动杆菌体系的构建。其次,通过冰冻切片图和解剖图解析了桃蚜的内部结构以及确定了前肠的分布位置和形态特征;借助苏丹III染色的冰冻切片图和解剖图,证实了在桃蚜腹部空间的内脏器官周围（如肠道）、体腔壁（腹部背、近外壳处）、头部等均有脂肪存在;分别对饲喂了GFP标记醋酸钙不动杆菌1天,2天,3天的桃蚜冰冻切片和相应对照组切片,使用激光共聚焦显微镜进行观察,结果发现所有对照组均无点状绿色荧光出现,但随着饲喂天数的增加,点状绿色荧光的数量也不断增加,且这些点状绿色荧光均分布在蚜虫近体腔壁处。以上结果表明,饲喂的带GFP标记醋酸钙不动杆菌经肠道扩散到外面的组织中。另外,对解剖分离得到的脂肪滴,用激光共聚焦显微镜观察,结果发现有发绿色荧光的脂肪滴,同时将吸取的脂肪滴涂布到带氨苄抗性LB固体培养基上,能够分离得到带GFP标记的原醋酸钙不动杆菌,这些结果表明醋酸钙不动杆菌能经桃蚜肠道扩散到脂肪体等组织中去,而且可以在新蚜虫疠霉侵染后通过附着在脂肪滴上进入真菌菌丝体体内。五、新蚜虫疠霉与醋酸钙不动杆菌共生状态下RNA-seq数据分析。通过RNA-seq技术获得新蚜虫疠霉真菌与醋酸钙不动杆菌共生状态下转录组信息,从细菌角度分析真菌细菌互作的转录组数据发现,两个样品（Pn-Ac₀1和Pn-Ac₀2）总共比到3365个基因,其中样品Pn-Ac₀1中比对到527个基因,Pn-Ac₀2中比对到3365个基因,从中发现了与在真菌细菌共生关系中发挥重要作用的Ⅵ型分泌系统（T6SS）相关基因22个。T6SS系统管道结构蛋白Hcp在样品Pn-Ac₀1和Pn-Ac₀2中表达水平FPKM值分别为3856.48和6607.49;在Pn-Ac₀2中发现四种VgrG针尖状结构蛋白,表达水平FPKM值分别为91.77、77.94、138.41和65.07;Imp系列蛋白中,ImpB、ImpC、ImpH三种蛋白在两样品中表达水平FPKM值分别为1928.24和687.82、936.57和58.2、623.63和703.95。T6SS系统供能相关ATP结合蛋白亚基ClpB、ClpX、ClpP、ClpA表达水平FPKM值分别为7797.11和6467.52、3528.19和2325.44、1582.88和1140.18、402.34和677.78。本研究完成了新蚜虫疠霉真菌共生细菌的验证及其它们之间的互作研究,为深入开展后续以寄主蚜虫为主体的“共位互作”的免疫相关研究打下了良好的研究基础。