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背景:膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,75％-85％为浅表性膀胱癌。膀胱癌有多灶性,易复发的特点,术后1年内复发率可以高达70％-80％,而且约有20％-30％复发患者可有肿瘤细胞级别的升高。术后给予定期膀胱灌注化疗对预防膀胱癌的复发尤为关键。目前临床中大多以单药行膀胱内灌注化疗,虽然其可降低约50％的肿瘤复发危险性,但是对于中高度危险性的患者,疗效则不尽如人意。导致膀胱内灌注化疗无效的原因很多,其中肿瘤细胞耐药的问题受人关注。联用化疗药物进行膀胱内灌注,来增加疗效,减少肿瘤细胞的耐药这已经受到学者的广泛关注,但这也带来了药物之间的组配、浓度、用药间隔时间及联用药物产生的毒性反应等一系列问题,对这些问题需要进一步的基础研究、临床试验加以证实。
目的:在体外联合应用丝裂霉素(MMC)与羟基喜树碱(HCPT)作用于浅表性膀胱癌模型5637细胞株,通过与单独应用两药进行比较,观察两药联合应用是否存在协同作用,并揭示可能存在的协同作用机制,为临床联合MMC与HCPT行膀胱内灌注提供理论依据。在体外研究MMC对高危膀胱癌5637细胞株作用后,Nuclear Factot-kappa B及其下游凋亡相关基因和多药耐药相关基因表达的变化,从而揭示5637细胞株对MMC产生耐药的可能机制,为临床应用MMC产生肿瘤细胞耐药提供理论依据。
方法:四甲基偶氮唑盐(MIT)法检测在不同浓度、不同作用时间下,单药组(MMC、HCPT)、联合组(MMC+HCPT)的细胞抑制率;流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测不同作用时间下,单药组与联合用药组的细胞凋亡率;荧光定量PCR检测单药组与联合用药组细胞中凋亡相关基因bcl-2的变化。运用免疫细胞化学(免疫荧光法)和Western blot方法检测N F-kB在加药(MMC)前后,5637细胞中的分布情况。运用荧光定量PCR的方法测定sorvivin基因及多药耐药基因mdr-1(NF-kB的靶基因)在加药(MMC)前后5637细胞中表达量的变化。
结果:MTT法显示:5637细胞株在经过MMC和HCPT联合作用12小时后,在部分浓度显示细胞抑制率高于两药单独应用,在作用24小时后,细胞抑制率明显高于两药单独应用。流式细胞术显示:5637细胞株在经过HCPT作用12小时后,可观察到明显的细胞凋亡,而MMC组和联合组均不如HCPT明显,联合组在药物作用24小时后细胞凋亡率均高于MMC与HCPT单药组,MMC组作用24小时后细胞凋亡率较正常对照组还低。荧光定量PCR:5637细胞株在经过MMC作用12小时后,bcl-2基因表达量较未加药组下降了3.61倍,HCPT单药组下降7.1倍,联合用药组则下降了7.41倍。MMC作用于5637细胞株后,免疫荧光和Westernblot均显示NF-kB未受到明显激活,其下游survivin表达明显上调,多药耐药基因mdr-1上调。
结论:联合应用MMC和HCPT相较于单药应用,对5637细胞株显示更强的细胞抑制作用,两药有协同作用。 Bcl-2基因表达的下调,可能是HCPT诱导细胞凋亡的机制之一。MMC可能并未通过对NF-kB的作用影响5637细胞的凋亡过程。MMC由另一通路激活5637细胞中的survivin基因,并可能是膀胱癌细胞5637对MMC耐药的原因之一。阻断survivin的表达可能是促进MMC作用效率的一条新的途径。