论文部分内容阅读
牦牛作为青藏高原地区重要物种资源,通过辅助繁殖技术提高其繁殖性能对我国“丝绸之路经济带”畜牧业的发展至关重要。为了提高体外生产牦牛胚胎的质量,阐明生长因子对牦牛体外胚胎发育的调控作用,及其对细胞凋亡的影响,并试图通过生长因子改善牦牛卵母细胞和胚胎冷冻技术,本研究进行了以下实验并取得了一定成果。(1)采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟及体外受精胚胎发育过程中EGF及EGFR表达动态,分析EGF对牦牛卵母细胞成熟率、胚胎发育能力、囊胚质量的影响,并检测细胞凋亡相关基因的表达变化。研究发现卵母细胞成熟和胚胎发育各个时期均可表达EGF和EGFR,且成熟卵母细胞的表达水平高于未成熟卵母细胞,囊胚的表达水平高于其他发育时期的胚胎,EGFR的表达水平高于EGF。加入EGF可以显著提高卵母细胞的成熟率、胚胎的发育能力和囊胚质量,最佳的作用浓度为100 ng·mL-1。EGF作用后成熟卵母细胞中促凋亡基因Bax表达显著降低(p?0.05),而抗凋亡基因Baxi的表达水平显著增加(p?0.05),囊胚中HSP70和Survivin的表达也可在100 ng·mL-1 EGF处理组中显著提高。结果表明牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中EGF和EGFR作为重要的自分泌或旁分泌因子,可通过调控Bax、Baxi、HSP70和Survivin等凋亡相关基因的表达提高牦牛卵母细胞和体外受精胚胎的发育能力。(2)运用Real-time PCR、WB和间接免疫荧光方法从基因和蛋白水平检测COCs成熟及体外受精胚胎发育过程中IGF-1及IGF-1R表达动态,同时在牦牛卵丘细胞体外培养、体外胚胎发育中加入不同浓度的IGF-1,分析卵丘细胞的凋亡率及凋亡相关基因的表达变化,及其对胚胎发育能力的影响。研究发现卵母细胞成熟和胚胎发育各个时期均可表达IGF-1和IGF-1R,成熟卵母细胞的表达水平高于未成熟卵母细胞,囊胚的表达水平高于其他发育时期的胚胎,IGF-1R的表达水平高于IGF-1、外源的IGF-1可以显著提高卵母细胞的成熟率、胚胎的发育能力和囊胚质量,浓度为100 ng·mL-1时,作用效果最佳。体细胞培养过程中IGF-1可以显著降低细胞凋亡率(p?0.05),在IGF-1浓度为100 ng·mL-1处理组中卵丘细胞的凋亡率最低,且Bax的表达水平最低,HSP70和Bcl-2的表达水平最高。研究结果表明,igf-1可调节卵丘细胞的hsp70、bax和bcl-2表达,降低细胞凋亡率,且igf-1在牦牛移植前胚胎发育过程中作为重要的生长因子,可以提高囊胚的形成和细胞增殖。(3)采集6月龄和24月龄牦牛睾丸组织,real-timepcr、wb和ihc方法从基因和蛋白水平分析牦牛睾丸发育过程中egf和egfr的表达变化;在牦牛冻精体外获能过程中加入不同浓度的igf-1,分析获能后精子的活性、评估不同处理组受精后胚胎的卵裂率,并采用real-timepcr、wb和间接免疫荧光方法从基因和蛋白水平检测igf-1对牦牛精子bax和bcl-2表达的变化。研究发现24月龄牦牛睾丸组织中egf和egfr的表达水平显著高于6月龄睾丸组织(p?0.05),egfr的水平高于egf,24月龄睾丸组织中表达更广,睾丸间质细胞、曲精小管肌上皮细胞、睾丸支持细胞、生殖细胞和精子均可表达egf和egfr。100ng·ml-1igf-1可以显著提高牦牛的精子活性(p?0.05),该处理组中受精后胚胎卵裂率也显著提高(p?0.05),而精子中bax基因的表达显著降低,bcl-2表达增加。综上表明生长因子可调控牦牛精子的生成和活性,从而促进后续胚胎的发育,且这种调控作用与细胞凋亡有关。(4)牦牛卵母细胞体外成熟过程中加入不同浓度的bmp6,分析卵母细胞成熟率、用成熟的卵母细胞生产克隆胚胎,并评估其发育能力,采用real-timepcr和间接免疫荧光方法分析2细胞胚胎和囊胚中h3k9ac,h3k18ac,和h3k9me3表达的变化,同时分析囊胚bax和bcl-2的表达。研究发现100ng·ml-1bmp6可以显著提高卵母细胞成熟率、克隆胚胎卵裂率和囊胚形成率(p?0.05),囊胚质量也有所提高。在bmp6处理组中,h3k9ac、h3k18ac、bcl-2基因表达增加、而bax、h3k9me3基因表达降低,h3k9ac,h3k18ac,和h3k9me3在2细胞克隆胚胎的表达差异更显著(p?0.05)。研究结果表明bmp6可以提高牦牛卵母细胞和后续克隆胚胎的发育潜能,其作用类似于其他osfs,且这种调节作用与其调控组蛋白修饰和细胞凋亡有关。(5)收集牦牛cocs,采用ct和ssv方法对其进行玻璃化冷冻,冷冻-解冻后分析不同处理组卵母细胞的成熟率和胚胎发育能力,采用real-timepcr、wb从基因和蛋白水平检测成熟卵母细胞、卵裂胚胎、和囊胚中hsp90的表达变化;同时在牦牛卵母细胞体外成熟过程中加入不同浓度的igf-1,分析卵母细胞的成熟率和CIRP的表达水平,将不同处理组成熟的卵母细胞采用CT法玻璃化冷冻,冷冻解冻后进行孤雌激活,分析胚胎的发育能力。研究发现CT和SSV冷冻组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率比较接近、其中成熟率和卵裂率显著低于对照组(p?0.05),HSP90的表达水平也低于对照组,而三组囊胚率和HSP90的表达水平比较接近。100 ng·mL-1 IGF-1可以提高成熟卵母细胞CIRP表达和卵母细胞的成熟率,冷冻-解冻后孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率有所提高,但囊胚质量差异不显著。结果表明CT和SSV玻璃化冷冻方法对牦牛未成熟卵母细胞具有相同的冷冻效果,且其对发育能力的影响主要集中在成熟期到早期卵裂期,并与HSP90的表达水平有一定关联性,而卵母细胞成熟过程中IGF-1可以调控CIRP的表达,提高成熟卵母细胞对低温的适应能力,降低低温对卵母细胞损伤,从而提高后续发育能力。