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目的： 众所周知食管癌已严重的威胁着人类的生命健康，而食管癌的分布具有明显的地域差异性，中国食管癌分布主要集中在太行山地区。虽然近些年来食管癌的诊断和治疗都取得了进步，但5年生存率仍达不到15％，食管癌的致病原因众多，发病机制复杂且不明确，阻碍了食管癌的预防和治疗。 Pak4作为Paks家族中的一员，参与了多条肿瘤相关的信号通路。Paks是一类由p21活化的蛋白激酶，是进化相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。同时，Paks是连接Rho GTP酶与细胞骨架重组以及核信号传导的关键因子。越来越多研究发现Pak4在多种肿瘤中过表达或过度活化。本实验室之前的研究结果表明Pak4在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞中均高表达，降低Pak4的表达能够有效抑制食管鳞癌细胞的增殖，迁移和侵袭，过表达Pak4得到了相反的结果，体内外实验均验证了这一结果。然而，Pak4在食管鳞癌中的作用靶点仍然不清楚。本实验为了进一步寻找Pak4在食管鳞癌中的作用靶点，利用质谱分析对食管鳞癌中可能与Pak4结合的多个蛋白进行功能性的分析和筛选，最终发现LASP1可能是Pak4在食管鳞癌中潜在的作用靶点。 LASP1是新发现的细胞结构骨架蛋白，定位于17q21染色体上，高表达于胃肠道和造血系统中。与其他蛋白不同，LASP1有LIM和SH3两个结构域，其中，在SH3结构域有许多结合伴侣的结合位点，并能与之结合发挥功能。研究表明，LASP1通过参与肿瘤细胞伪足结构的形成，促使蛋白金属酶MMP分泌到细胞外基质(ECM);LASP1缺失时会使细胞阻滞在G2/M期;LASP1还同时参与了PI3K/AKT通路，促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭。 通过免疫共沉淀和激光共聚焦实验来进一步验证Pak4能否与LASP1相互结合。通过敲低和过表达LASP1在食管鳞癌细胞中的表达水平来探究其对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。最后，通过体内实验，利用过表达Pak4的食管鳞癌细胞进一步验证Pak4对食管鳞癌迁移和侵袭的影响，并通过检测LASP1的表达水平和相关信号通路的改变，进一步明确Pak4在食管鳞癌中的作用机制，也为Pak4可能成为食管鳞癌的新靶点提供实验基础和理论依据。 方法： 1.质谱分析:首先利用Pull down实验，筛选带有6×His标签的Pak4蛋白，与食管鳞癌KYSE450细胞共同孵育，洗脱蛋白，考马斯亮蓝染色筛选出差异的蛋白条带，寻找可能与Pak4相互作用的蛋白。 2.对上述蛋白条带进行消化，酶解，上机分析。对质谱分析得到的数据进行GO功能分析和筛选，最终筛选出三个候选的潜在作用分子。 3.外源性免疫共沉淀:通过将Pak4和LASP1共转染到293T细胞中，通过免疫共沉淀实验验证Pak4与LASP1之间的结合情况。 4.激光共聚焦:在食管鳞癌细胞Eca109中分别用不同的荧光标记Pak4和LASP1，通过激光扫描共聚焦显微镜观察两个蛋白在食管鳞癌细胞中的定位情况。 5.载体构建:设计5条关于LASP1的sh-RNA，构建相应五个以PLKO.1为载体的sh-LASP1质粒，为敲低LASP1表达做准备。 6.LASP1敲低稳定细胞株建立:通过病毒感染使LASP1表达量相对较高的Eca109和KYSE150食管鳞癌细胞株的LASP1表达量降低。 7.LASP1表达量鉴定:用Western blotting鉴定建立的细胞株中LASP1的敲低和过表达效率。 8.细胞增殖实验:验证分别降低和升高LASP1的表达后，对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。 9.软琼脂克隆实验:探究LASP1的低表达和高表达，对食管鳞癌细胞克隆形成能力的影响。 10.平板细胞划痕实验:观察敲低和过表达LASP1，对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。 11.Transwell侵袭实验:评价LASP1表达量的降低和升高，对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响 12.体内移植瘤实验:将Pak4过表达的食管鳞癌细胞和对照细胞皮下注射入小鼠皮下，观察Pak4过表达裸鼠移植瘤生长情况。 13.体内肿瘤转移模型:将Pak4过表达的食管鳞癌细胞和对照组细胞通过尾静脉注射入SCID小鼠体内，观察Pak4过表达后肿瘤在肝、肺的转移情况。 结果： 1.通过质谱分析，筛选出能够与Pak4结合的潜在作用分子。 2.通过TCGA数据库比对分析，发现Pak4与LASP1的相关性最为密切。 3.免疫共沉淀实验发现，Pak4和LASP1能够在293T细胞内结合，激光共聚焦实验发现Pak4和LASP1能够在食管鳞癌细胞Eca109中共定位。 4.LASP1表达降低后，有效的抑制了食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。 5.LASP1表达升高后，有效的促进了食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。 6.体内裸鼠移植瘤实验发现，过表达Pak4促进食管鳞癌细胞的增殖，与对照组相比，Pak4过表达组小鼠肿瘤生长速度与肿瘤大小明显高于对照组。 7.体内肿瘤转移实验证明，与对照组相比，过表达Pak4组小鼠肺部和肝脏的结节数量明显高于对照组。 结论： 1.Pak4能够与LASP1在体外和细胞内相互结合和共定位。 2.降低LASP1表达会抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达LASP1会促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。体内实验表明Pak4通过调控LASP1，促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。