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研究目的:随着人们生活水平提高,脂肪摄入量增多、运动量减少等不健康的生活方式导致人群患肥胖症和其它代谢性疾病的比例逐渐增多,并由此引起的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的患病率也在逐年升高。本课题通过对非酒精性脂肪性肝病患者的血清标本、高脂饮食诱导建立的C57/BL6小鼠脂肪性肝病模型以及油酸诱导建立的人肝细胞株L02脂肪变模型进行实验分析,旨在探究转录因子TWIST1、TWIST2和PPA:Ry在非酒精性脂肪性肝病中的表达变化,为非酒精性脂肪性肝病的诊断和治疗提供新线索。研究方法:1.临床标本的收集及检测:收集了2017.12-2018.04月在山东大学附属千佛山医院体检中心进行健康查体的共计406例血清标本,根据影像学结果将其分为健康对照组、轻度NAFLD组、中度NAFLD组和重度NAFLD组。使用ELISA方法检测血清标本中的TWIST1、TWIST2以及PPARγ的浓度。2.动物模型的建立及实验:使用高脂饮食喂养的方法诱导C57/BL6小鼠建立非酒精性脂肪性肝病模型,分别于第4、8、12、16周末处理小鼠,用其肝组织的冰冻切片进行H-E染色、油红O染色,并后期提取肝脏组织蛋白进行Western Blot实验检测转录因子TWIST1、TWIST2和PPARγ在其中的表达变化。在第16周末小鼠牺牲之前进行腹腔内葡萄糖耐量实验(IPGTT)和腹腔内胰岛素耐量实验(IPITT)。3.细胞模型的建立及实验:使用油酸(50μg/mL)诱导建立正常人肝细胞株L02的脂肪变模型,通过油红O染色观察L02细胞内脂肪滴的形成并进行半定量分析,通过Western Blot实验检测转录因子TWIST1、TWIST2和PPARγ在细胞模型中的表达变化。4.L02细胞LncRNA/mRNA表达谱分析:委托上海康成生物工程有限公司代为完成。研究结果:1.人血清标本:随着脂肪肝严重程度的增加,所收集患者的体质指数(BMI)、空腹血糖水平、空腹胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数HOMA-IR均升高,差异有统计学意义(P<0.05);轻度NAFLD组血清中的TWIST1浓度较其他组均降低,差异有统计学意义(P<0.05);中度NAFLD患者血清中的TWIST1浓度较健康对照组、轻度NAFLD组和重度NAFLD组均升高,差异有统计学意义(P<0.05);NAFLD各组患者(轻度、中度以及重度)血清中的TWIST2浓度均较健康对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);NAFLD各组患者血清中的TWIST2浓度比较无差异;NAFLD患者(轻度、中度以及重度)和健康对照者血清中的PPARγ的浓度比较,差异不具有统计学意义;血清中的TWIST1和TWIST2浓度的相关性分析,Pearson相关系数为0.810;血清中的TWIST1和PPARγ的相关性分析:Pearson相关系数为0.797;血清中的TWIST2和PPARγ的相关性分析,Pearson相关系数为0.812。2.动物实验:自造模第5周开始,HFD(高脂饮食)组小鼠体重高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);HFD组小鼠肝脏较对照组小鼠肝脏表面油腻、颜色偏白,肝组织冰冻切片H-E染色可见肝腺泡区以大泡为主的肝细胞脂肪变性,并有肝细胞的气球样变,肝小叶内浸润有各种炎性细胞;油红O染色可见明显的脂滴;造模第16周末的小鼠分别进行腹腔内葡萄糖耐量实验(IPGTT)和腹腔内胰岛素耐量实验(IPITT),HFD组的小鼠不同时间点的血糖浓度均高于对照组,且HFD组小鼠注射葡萄糖后血糖浓度下降缓慢,对胰岛素的反应性较对照组小鼠差,提示HFD组小鼠存在胰岛素抵抗;对生长不同时间的小鼠肝脏组织蛋白进行Western Blot实验分析,HFD组与对照组相比,肝脏TWIST1和PPARγ的表达均无明显变化;造模时间3个月的HFD组小鼠肝脏TWIST2表达水平较对照组下降45.30%,差异有统计学意义(P<0.05)。3.细胞实验:油酸诱导肝细胞脂肪变模型组与正常对照组进行油红O染色,模型组L02细胞内可见明显的脂滴,使用异丙醇将油红O脱色后半定量分析,模型组的吸光度明显升高;提取细胞总蛋白进行Western Blot分析,诱导相同时间的模型组与对照组细胞转录因子TWIST1和PPARγ的表达水平均无明显变化,但随着细胞培养时间的延长,L02细胞内转录因子TWIST1和PPARy的表达水平均有升高的趋势;模型组细胞转录因子TWIST2的表达水平在诱导第48h、72h较对照组分别下降23.49%和25.68%,差异有统计学意义(P<0.05)。4.L02细胞LncRNA/mRNA表达谱分析:将油酸(50 μg/mL)诱导48 h的模型组L02细胞与对照组细胞进行mRNA表达谱分析,芯片检测13823个基因mRNAs信号,模型组细胞中230个基因mRNAs出现不同程度的上调,377个基因mRNAs出现不同程度的下调。通过差异表达mRNAs生物功能预测富集分析显示,共有507个差异表达mRNAs参与到了生物过程中;与对照组细胞比较,模型组细胞的差异mRNAs参与到1095项生物过程,富集分析呈显著性差异(P<0.05),其中上调的差异mRNAs参与586项生物过程,下调的差异mRNAs参与509项生物过程。与对照组细胞比较,模型组的胰岛素信号转导和葡萄糖转运相关生物过程存在显著差异。差异表达mRNAs参与的通路预测分析结果发现,与对照组细胞比较,模型组的差异mRNAs参与到41个信号通路中,其中上调的差异mRNAs主要参与36条信号通路,下调的差异mRNAs主要参与5条信号通路;差异表达基因mRNAs在PPAR信号通路中被显著性富集。研究结论:1.转录因子TWIST2在肥胖所致的非酒精性脂肪性肝病的发病过程中表达下降;2.转录因子TWIST1和TWIST2与PPARy存在正向相关性;3.在L02肝细胞脂肪变模型中,有一系列的mRNAs差异表达并且存在着胰岛素抵抗,差异表达基因mRNAs在PPAR信号通路中被显著富集。