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研究背景:白癜风是一种获得性黑素细胞(MC)破坏所致皮肤和毛发的色素脱失性疾病。它虽然对人的身体没有大的损害,但是影响美容,进而患者产生心理压力,导致严重的心理问题。其发病机制目前尚不清楚,国内外大量研究表明,该病发病机制可能与遗传、免疫、神经精神等方面有关。近年来越来越多研究发现在白癜风发生和发展过程中有很多细胞因子参与。研究证实围绕在MC周围的角质形成细胞(KC)能分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮素-1(ET-1)及干细胞因子(SCF)。bFGF及ET-1是MC生长分化的重要因子,是MC的内源性促分裂剂。ET-1还可通过受体介导的信号传导途径刺激MC增殖,黑素生成及增加酪氨酸酶(Tyr)的活性。SCF能够刺激体外培养的MC增殖和促进移植表皮的存活。因此,研究这些细胞因子对于探索白癜风的发病机制及寻找白癜风治疗新方法具有一定的意义。近年来临床使用驱虫斑鸠菊(vernoniaanthelmintica,VW)配合紫外线(UV)照射治疗白癜风,取得了显著疗效,但其治疗机制尚不清楚。除了直接作用于MC,使其活化、增殖,并迁移到皮损区达到复色外,推测其还可能与KC分泌的细胞因子介导的MC增殖和迁移有关。实验目的观察VW分别联合中波紫外线(UltravioletB,UVB)及长波紫外线(Ultr-avioletA,UVA)照射对人永生化角质细胞株(HaCaT细胞)产生细胞因子的影响作用;观察VW分别联合UVB、UVA照射通过作用HaCaT细胞后的上清液对培养的人黑素细胞瘤A375细胞株(A375细胞)增殖和迁移的影响。实验方法1.细胞培养:以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养HaCaT细胞及A375细胞,分别接种于6孔或96孔培养板中。2.紫外线照射:根据实验设计使用UVB及UVA照射培养的HaCaT细胞,分别于照射前24h使用无血清DMEM培养基培养,使用VW配合UVB或UVA照射及VW的实验组在照射前2h使用VW进行干预处理,并设阴性对照组。3.各组上清液的收集:48小时后收集各组上清液,经1000g离心5分钟,分装后-70℃保存。4.各组上清液中细胞因子含量的测定:使用ELISA试剂盒测定细胞上清液中的bFGF、ET-1及SCF的含量。5.A375细胞增殖实验:各组上清液作为条件化培养基培养A375细胞,MTT法检测各组条件化培养基对A375细胞增殖的影响。6.A375细胞迁移实验:各组上清液作为条件化培养基趋化A375细胞,使用Transwell小室检测各组条件化培养基对A375细胞的趋化能力。7.统计学分析:采用单因素方差分析,数据处理应用SPSS11.0统计软件,P<0.05时差异有统计学意义。实实验结结果1.VW联联合UVB,VW联联合UVA,VW,UVB及UVA对HaCaT细细细细胞胞胞分分泌bFGF、ET-1及SCF的的的影影响.VW联合UVB及UVB组HaCaT细胞分泌bFGF的量(分别为119.430±6.828ng/L及102.839±6.826ng/L)明显高于阴性对照组(62.982±8.250ng/L)(P<0.05),此两者间相比则没有显著性差异(P>0.05)。表明VW联合UVB及UVB都能促进HaCaT细胞分泌bFGF。VW联合UVB及UVB组HaCaT细胞分泌ET-1的量(分别为4.470±0.192g/L及4.233±0.116g/L)明显高于阴性对照组(3.820±0.212g/L)(P<0.05),此两者比较亦无显著性差异(P>0.05)。表明VW联合UVB及UVB都能促进HaCaT细胞分泌ET-1。VW联合UVB组HaCaT细胞分泌SCF的量(128.27±3.35ng/L)明显高于阴性对照组(103.60±8.67ng/L)(P<0.05),表明VW联合UVB能够促进HaCaT细胞分泌SCF。UVB组HaCaT细胞分泌SCF的量(113.64±7.39ng/L)与阴性对照组相比较,无显著性差异,表明UVB不能促进HaCaT细胞分泌SCF。VW联合UVA组、VW组及UVA组分泌的bFGF、ET-1及SCF的量与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05),表明这些组都不能促进HaCaT细胞分泌bFGF、ET-1及SCF。2.VW联联合UVB,VW联联合UVA,VW,UVB及UVA作作用HaCaT细细细细胞胞胞胞后后后的的上清清清液液对A375细细细细胞胞胞增增殖效效应的的的影影响VW联合UVB组及UVB组作用HaCaT细胞后的上清液作为条件化培养基培养A375细胞48h后,吸光度A值(分别为0.582±0.0554及0.509±0.060)明显大于阴性对照组(0.332±0.070)(P<0.05),此两者间相比没有显著性差异(P>0.05)。表明VW联合UVB及UVB都能通过刺激HaCaT细胞后促进A375细胞增殖。VW、VW联合UVA及UVA作用HaCaT细胞后的上清液对A375细胞增殖效应的促进作用与阴性对照组相比均无明显差异(P>0.05),表明这些组都不能通过HaCaT细胞促进A375细胞的增殖。3.VW联联合UVB,VW联联合UVA,VW,UVB及UVA作作用HaCaT细细细细胞胞胞胞后后后的的上清清清液液对A375细细细细胞胞胞迁迁移的的的影影响VW联合UVB组及UVB组作HaCaT后的细胞上清液作为条件化培养基趋化A375细胞,通过Transwell小室微孔滤膜的细胞个数(分别为72±6个/40倍镜视野及60±5/40倍镜视野)明显多于阴性对照组(42±13个/40倍镜视野)(P值分别为0.003及0.035),此两者之间相比无显著性差异(P>0.05)。说明VW联合UVB及UVB作用HaCaT细胞后的上清液能促进A375细胞的迁移。并且UVB与VW刺激HaCaT细胞后促进A375细胞迁移有协同效应。VW、VW联合UVA及UVA作用HaCaT细胞后的上清液对A375细胞迁移的促进作用与阴性对照组相比较均无明显差异(P>0.05),表明VW、VW联合UVA及UVA都不能通过HaCaT细胞促进A375细胞迁移。结论1.VW联合UVB组及单用UVB组能够上调HaCaT细胞分泌bFGF、ET-1,并且它们的上清液能够促进A375细胞的增殖及迁移。这提示临床上使用VW联合UVB及单独UVB治疗白癜风可能通过促进KC分泌bFGF及ET-1刺激MC增殖及迁移。2.VW联合UVB组能显著促上调HaCaT细胞分泌SCF,但UVB无促进HaCaT细胞分泌SCF。这可能和临床上使用VW联合UVB治疗白癜风的疗效强于单用UVB有关。3.本次实验中,VW联合UVA、VW及UVA没有明显促进HaCaT细胞分泌bFGF、ET-1及SCF,它们的上清液也没有促进A375细胞的增殖和迁移。这说明可能是通过其它机理来达到皮损白斑区的复色。