论文部分内容阅读
本文的研究目的是利用纤维素硫酸钠-聚二甲基二烯丙基氯化铵（NaCS-PDMDAAC）生物微胶囊系统固定化培养重组盘基网柄菌,以提高其细胞密度并高通量表达目的蛋白。由于纤维素硫酸钠（NaCS）尚未商品化,故本文先对纤维素硫酸钠的制备工艺进行了研究。在成功制备出纤维素硫酸钠后,对NaCS-PDMDAAC微胶囊进行了一些表征,然后将其应用到细胞培养中。首先利用硫酸和正丙醇作为反应液制备纤维素硫酸钠。为了减小纤维素硫酸钠的制备成本,用无水乙醇代替了反应液中的正丙醇。利用响应面实验设计,在100 mL反应液体系下,以制备胶囊（2%NaCS溶液滴加到6%PDMDAAC溶液中,反应10 min）的机械强度为响应值,优化了反应液中酸醇比和反应时间的影响,得到制备纤维素硫酸钠的最佳条件为酸醇比1.51:1,反应时间60.9min,相应的微胶囊机械强度为463g。为了进一步降低制备成本,对反应液的重复利用进行了研究,发现反应液可以重复利用3次。将制备纤维素硫酸钠的反应体系放大到1000mL,取得了良好的放大效果。对最佳条件下制备得到的纤维素硫酸钠的取代度和粘度进行了测量,其取代度为0.29,而4%的NaCS溶液动力粘度高达489mPa.s。在成功制备出纤维素硫酸钠后,对NaCS-PDMDAAC微胶囊做了一些表征。对微胶囊的直径和膜厚进行了测量,并对膜的结构进行了扫描电镜的拍摄。考察了影响微胶囊机械强度的因素,发现在胶囊球形度良好的情况下,其机械强度可高达2010g,远远高于文献报导。对微胶囊在长时间振荡中的抗剪切性能进行了研究,将胶囊放在摇瓶中置于摇床上150rpm振荡时,在44天内未出现破碎。利用NaCS-PDMDAAC微胶囊体系对表达人类可溶性Fas配体（shFasL）的重组盘基网柄菌进行了固定化培养。首先考察了微胶囊体系和盘基网柄菌的生物相容性,发现NaCS对细胞的生长有一定的促进作用,而且细胞在微胶囊内生长良好,表现出较好的生物相容性。对微胶囊应用于盘基网柄菌固定化培养的制备条件进行了优化,得到的最佳条件是NaCS浓度3.59%,PDMDAAC浓度6.18%,反应时间15.4min。在优化条件下,分别在复杂HL-5C培养基和全合成SIH培养基中对盘基网柄菌进行了固定化培养,细胞密度分别达到了1.61×108mL-1和1.92×108mL-1,是悬浮培养时的6～8倍,胶囊内产物shFasL的浓度分别达到了1057μg L-1和1216μg L-1,是悬浮培养时的4～7倍。对盘基网柄菌在固定化条件下的多批次培养进行了研究,在细胞生长到一定时期后,将固定化细胞进行回收,并转移到新鲜的培养基中培养,结果细胞出现了二次生长,整个培养过程可以持续20～30天,最高细胞密度达到了2.02×108 mL-1,最大产物浓度达到1304μgL-1。最后,利用鼓泡塔生物反应器在HL-5C培养基中对固定化细胞的培养进行了初步的放大。结果表明细胞在鼓泡塔中的生长速度比摇瓶中略慢,但是可以达到比摇瓶略高的细胞密度,为1.73×108 mL-1。