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青光眼是一种视神经退行性病变,是全球首位不可逆性致盲性眼病。病理性眼压（intraocular pressure,IOP）增高是青光眼的主要危险因素,视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）死亡及其轴突变性是影响青光眼患者视功能的最终因素。降低IOP是目前青光眼治疗的唯一有效办法,但并不能完全阻止RGCs丢失对视功能的影响。因此,开发直接作用于RGCs及其轴突的神经保护药物对青光眼治疗至关重要。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）是细胞内重要的辅酶,在神经细胞代谢及正常功能中发挥重要作用。包括青光眼在内的多种神经退行性疾病的发病均与NAD+代谢异常有关。烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）是NAD+重要的前体类药物之一,在多种动物模型及临床研究中表现出良好的生物利用度及安全性。NR在多种神经退行性变动物模型中均有显著的神经保护作用,但其在青光眼中的保护作用尚未被探究。研究常用的实验性青光眼动物模型可分为IOP依赖性动物模型、非IOP依赖性动物模型及遗传性青光眼动物模型。本研究探究NR通过不同给药方式在三种实验性青光眼小鼠模型中的保护作用及其作用机制。研究首次揭示NR系统性治疗在实验性青光眼小鼠模型中存在显著的神经保护作用,初步阐明NR提高视网膜NAD+浓度、抑制视网膜神经炎症反应及RGCs凋亡的作用机制。第一部分NR在视神经夹伤小鼠模型中的保护作用目的:探究NR在非IOP依赖性实验性青光眼模型中的保护作用。方法:1.构建非IOP依赖性实验性青光眼模型——视神经夹伤（optic nerve crush,ONC）小鼠模型;2.NR/磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline,PBS）腹腔注射治疗开始于小鼠ONC术前两周（1000mg/kg小鼠体重,每周三次）;3.ONC术后三天,采用视网膜铺片及Brn3a免疫荧光染色技术观察RGCs存活率,借助TUNEL染色检测RGCs凋亡情况,通过图形视网膜电生理（pattern electroretinogram,PERG）技术了解小鼠RGCs功能学变化情况。结果:1.与正常对照组小鼠相比,PBS处理组小鼠在ONC术后早期出现RGCs存活率下降、RGCs凋亡比例增高及PERG振幅降低的现象;2.NR处理组与PBS处理组小鼠相比,RGCs凋亡比例减少,RGCs存活率及PERG振幅显著增高。结论:NR腹腔注射治疗在视神经损伤早期可以有效抑制RGCs凋亡,保护RGCs形态及功能。第二部分NR在高眼压小鼠模型中的保护作用目的:探究NR在IOP依赖性实验性青光眼小鼠模型中的保护作用。方法:1.构建IOP依赖性实验性青光眼小鼠模型——前房磁性微珠注射诱导的高眼压（ocular hypertension,OHT）小鼠模型;2.NR/PBS腹腔注射治疗开始于小鼠前房微珠注射术前1天,并持续至术后60天（1000mg/kg小鼠体重,每周三次）;3.应用Tonolab眼压计动态监测小鼠IOP变化情况,使用视网膜铺片及Brn3a免疫荧光染色技术观察RGCs存活率;4.通过对小鼠IOP与RGCs数量相关性的研究,分析高IOP及NR处理对小鼠RGCs存活率的影响。结果:1.与正常对照组小鼠（IOP约为10mm Hg）相比,前房磁珠注射的PBS治疗组小鼠术后即出现IOP升高至20mm Hg左右,并持续至术后30天。术后60天RGCs存活率较正常对照组下降约15%;2.前房磁珠注射的NR治疗组小鼠术后同样出现眼压升高至20-30mm Hg,后稳定于20mm Hg并持续至术后40天左右。NR治疗组术后60天RGCs存活率较PBS治疗组显著提高;3.PBS治疗组小鼠IOP升高程度与RGCs存活率呈现显著负相关,NR治疗组小鼠并无此种显著相关性。结论:NR腹腔注射治疗在不降低OHT小鼠模型眼压的情况下显著提高RGCs存活率,提示NR治疗可降低RGCs对高眼压性损害的敏感性。第三部分:NR口服治疗在遗传性青光眼DBA/2J小鼠模型中的保护作用目的:探究NR口服治疗在遗传性实验性青光眼小鼠损伤模型中的保护作用。方法:1.药物治疗通过口服给药的方式进行,开始于DBA/2J小鼠4月龄（青光眼发病前）。实验设置NR高/低剂量组,同时设置等摩尔剂量的烟酰胺（nicotinamide,NAM）高/低剂量组以对比NR与NAM的保护作用;2.应用Tonolab眼压计在实验过程中动态监测小鼠IOP变化情况;3.通过对小鼠虹膜进行记录及损伤程度分级,评估各组小鼠虹膜萎缩及脱色素情况;4.使用视网膜铺片及Brn3a免疫荧光染色技术观察RGCs胞体存活率,利用视神经树脂包埋切片及甲苯胺蓝染色技术分析RGCs轴突存活率;5.实验过程中使用PERG技术动态观察小鼠RGCs功能。结果:1.DBA/2J小鼠IOP升高开始于小鼠7月龄,在9月龄时IOP达到峰值,随后IOP逐渐降低;12月龄时大部分DBA/2J小鼠出现明显的虹膜萎缩及脱色素情况,RGCs胞体及其轴突存活率显著降低;2.NR治疗可以显著缓解DBA/2J小鼠的虹膜萎缩及脱色素、阻止小鼠眼压升高、提高RGCs胞体及其轴突存活率、改善小鼠RGCs功能;3.NR在DBA/2J小鼠中的神经保护效果优于同等剂量NAM,且具有剂量依赖性。结论:在遗传性青光眼小鼠模型DBA/2J小鼠中,NR口服治疗具有显著的神经保护作用。此外,NR在DBA/2J小鼠中的神经保护作用优于等摩尔剂量的NAM,且NR的神经保护效果呈现剂量依赖性。第四部分NR通过抑制视网膜神经炎症反应在实验性青光眼小鼠模型中发挥保护作用目的:探究NR在实验性青光眼小鼠模型中的保护作用机制。方法:1.通过视网膜NAD+浓度测定技术检测NR处理后的野生型C57BL/6J小鼠、幼龄DBA/2J小鼠（未出现青光眼）及ONC小鼠模型、DBA/2J青光眼小鼠模型的视网膜NAD+浓度;2.采用免疫荧光染色技术标记视网膜中NR生成NAD+通路的关键性限速酶——烟酰胺核糖激酶1（nicotinamide riboside kinase1,NRK1）的表达;3.利用免疫荧光染色技术标记视网膜中神经炎症细胞,应用微滴数字PCR技术检测白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α等视网膜炎症因子的表达。结果:1.与PBS处理组相比,NR处理后的野生型C57BL/6J小鼠、幼龄DBA/2J小鼠及ONC小鼠模型、DBA/2J青光眼小鼠模型的视网膜NAD+浓度均显著升高;2.免疫荧光染色结果证实RGCs中存在NAD+生成通路的关键性限速酶——NRK1的表达;3.与PBS处理组相比,NR处理组小鼠视网膜Muller细胞及小胶质细胞的活化减少,视网膜炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达降低。结论:NR处理可有效升高野生型小鼠和实验性青光眼小鼠模型中视网膜NAD+浓度。NR在实验性青光眼小鼠模型中可显著抑制视网膜神经炎症细胞激活,降低视网膜炎症因子表达。图29幅,表2个,参考文献140篇