1、研究背景与目的痛风(gout)是由于嘌呤类物质代谢紊乱,尿酸产生过多和(或)尿酸排泄减少,血尿酸浓度持续增高导致尿酸盐结晶沉积软组织所致的一组代谢性疾病。其临床特点为由高尿酸血症、尿酸盐沉积所导致的反复发作性的急、慢性关节炎和软组织损伤,尿酸性肾结石所导致的痛风性肾病。近年来,由于生活方式的变化,发病率明显增加。我国普通人群中高尿酸血症患病率约为10%,痛风患病率约为0.58%。其中急性痛风性关节炎是成年男性最常见的炎症性关节炎,且呈年轻化趋势。痛风分为原发性和继发性两大类。原发性痛风其病因及发病机理至今尚未完全弄清,但其发生必需具备以下两个基本条件：(1)尿酸生成过多嘌呤代谢受一些酶的调节,研究表明原发性痛风与遗传缺陷导致这些酶的缺乏或活性改变有关。(2)尿酸排泄减少肾小球的滤过减少导致高尿酸血症主要见于慢性肾脏疾病引起肾功能衰竭,还有肾排尿酸阈值增高。原因未明。肾小管尿酸排泄减少与一些尿酸盐转运蛋白有关,其参与近曲肾小管对尿酸盐的主动分秘和重吸收,其异常与基因变异有关。继发性痛风多见于慢性肾病致肾功能减退,尿酸排泄减少(糖尿病酮症酸中毒、乳酸酸中毒等)、血液病、肿瘤化疗药引起核酸转换增加,尿酸生成增多或某些药物如噻嗪类利尿药、速尿、小剂量乙酰水杨酸；环孢素A、乙胺丁醇、乙醇、乳酸等代谢产物可抑制肾小管排泄尿酸导致尿酸升高。急性痛风性关节炎是由于尿酸钠(MSU)微晶体在关节周围组织沉积引起的急性炎症反应,其发病机制及自我缓解机制还不是很清楚。高尿酸血症中MSU结晶形成并沉积在软骨、滑膜及关节周围,平时无炎症表现。在某些因素作用下(如寒冷、创伤及饮酒等),结晶脱落进入关节腔,引起炎症级联反应。中医学中亦有“痛风”之名,元代朱丹溪明确地提出“痛风”的病名,“痛风者,四肢百节走痛,方书谓之白虎历节风证是也。大率有痰,风热,风湿,血虚”。后代医家将痹证中的痛痹、或痛痹与行痹并列称之为痛风,或白虎历节风。中医学认为,痛风的病因病机为先天禀赋不足,饮食劳倦,损伤脾肾,阳气亏损,寒湿内盛,瘀浊阻滞,且其寒之邪,多由外受,其湿之盛,皆因于内,属于本虚标实,虚实夹杂。先天禀赋、饮食劳倦与脾肾关系密切。脾主升清降浊,肾主蒸腾气化,膏粱厚味,损伤脾胃,脾失健运,升清降浊失司；肾失温煦,气化不足,均致寒湿内盛,气血运行不畅,流注经络骨节,凝滞不化,愈滞愈甚,闭阻经络,致使肢体关节疼痛,日久瘀血湿浊胶着,因寒而聚结,附于骨节,变生痛风结节,然后僵硬成石,致关节畸形,久病人肾,肾气亏乏,阳微而致肾衰。热休克蛋白(heat shock protein, HSP),又称应激蛋白,是生物细胞在应激原如受热、缺血、缺氧、创伤、饥饿等刺激后,发生热休克反应时所产生的一组高度保守的蛋白质。HSP能快速、短暂地调整应激过程中细胞的存活机能,保护细胞,抗御损伤,并有助于细胞恢复正常的结构与机能。HSP70是其中最保守和最重要的一族,在大多数生物中含量最多,在应激反应中最敏感以及在临床实践中有多种作用。HSP70主要具有以下主要生物学功能：分子伴侣作用、防止细胞凋亡、促进细胞增殖、具有免疫作用、使生物获得耐热性。最近研究表明,HSP70可参与免疫反应和抑制炎症反应,其在受损细胞表面的表达可帮助免疫系统识别清除毒性细胞。并可通过抑制活性氧簇和细胞因子起保护细胞和组织免受炎症损伤的作用。HSP70可协助抗原提呈细胞将抗原提呈给T细胞参与细胞免疫,抑制IL-1、TNF-a等炎症介质的表达；HSP70能通过阻碍P38丝裂原激活蛋白激酶所介导的信号通路,抑制IKB在细胞浆磷酸化及其降解,从而抑制NF-κB从细胞浆转移至细胞核,抑制NF-κB的激活,抑制炎症介质TNF-a、IL-6等的释放,减轻炎症反应；因此HSP70的表达可能对痛风性关节炎炎症的发生发展具有一定的影响作用。在GA临床治疗上,中医药有明显优势,具有从整体治疗,副反应少,临床疗效好,可长期服用的特点。痛风宁是多年用于治疗痛风性关节炎的经验方,具有清利痰浊、活血通络、理气止痛之功效,用于治疗痰湿瘀阻证的痛风性关节炎临床效果良好。其药物组成有：苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、川草薢、毛冬青、威灵仙、虎杖等。既往药理研究显示痛风宁冲剂具有显著的止痛、抑制炎症作用,但其具体的抗炎机制尚不明确。本课题采用痛风宁治疗急性痛风性关节炎大鼠,并通过检测急性痛风性关节炎大鼠受试关节滑膜组织中热休克蛋白的基因表达和蛋白合成情况,探讨热休克蛋白在炎症过程中发挥的作用,明确痛风宁是否通过对热休克蛋白表达的影响而对急性痛风性关节炎产生抗炎作用,为进一步开发痛风宁提供实验依据,也为利用热休克蛋白诱导剂防治急性痛风性关节炎提供一定的思路。2、方法与内容2.1.中药复方痛风宁组成：苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、川萆薢、毛冬青、威灵仙、虎杖等。2.2.急性痛风性关节炎大鼠模型制作：关节腔内注入尿酸钠结晶溶液,诱导急性关节炎模型。2.3.实验方法：雄性Wistar大鼠50只,随机分为空白组、模型组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组,每组10只。中药高剂量组30g/kg/日,中药低剂量15g/kg日,西药对照0.09mg/kg/日的秋水仙碱,模型组、空白组灌服生理盐水,每天2次,连用5天,并与用药的第三天造模型,造模后24小时观察大鼠步态,用药5天后,处死,取血,检测IL-1β、IL-10；取滑膜,提取RNA,HE染色及免疫组化染色。2.4.检测指标：2.4.1一般情况：大鼠神态,步态,活跃程度等。2.4.2滑膜病理：大鼠受试关节滑膜病理改变情况。2.4.3HSP70合成情况检测：采用LSAB免疫组化标记法。2.4.4HSP70mRNA表达检测：采用实时定量—聚合酶链反应(RT-PCR)检测。2.4.5血清IL-1β、IL-10检测：采用ELISA法检测。2.5.资料统计：用SPSS13.0统计软件分析,计量资料以x±s表示,SPSS13.0软件包处理数据,多组间均数比较用单因素方差分析,方差不齐采用近似F检验Welch法,DunnettT3进行多重比较；方差齐性采用LSD进行多重比较。P<0.05为存在明显统计学差异,P<0.01为具有显著统计学意义。3、结果3.1一般情况整个实验期间,正常组大鼠毛发光泽,双目有神,反应敏捷,进食正常；秋水仙碱组、中药痛风宁组、模型组大鼠在给予致炎后出现致炎足踝肿胀,患足不能着地,出现三足步态,活动严重受限。经治疗后秋水仙碱组、中药痛风宁组上述症状明显好转,模型组大鼠症状改善不明显。3.2痛风宁对大鼠病理形态的影响：正常组大鼠关节滑膜正常,模型组大鼠关节滑膜衬里层细胞明显增厚,损伤部位及周围可见炎细胞成堆,多形核白细胞、单核细胞、异物巨细胞等炎性细胞浸润；新生血管多处可见,血管腔明显扩张充血；痛风宁组及秋水仙碱组,其炎性白细胞浸润、血管扩张情况均不同程度低于模型组3.3HSP70表达情况：Levene检验方差齐性(F=0.078,P=0.989),采用LSD法检验。各组间比较差异具有统计学意义(F=74.525,P=0.000)。空白组HSP70表达最低,模型组略高于空白组但无统计学意义(P=0.195)；西药组、中药低剂量、中药高剂量组均高于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),有统计学意义；西药组、中药高剂量组表达高于中药低剂量组(P=0.000,P=0.000),有统计学意义；西药组、中药高剂量组表达差异无统计学意义(P=0.418)。3.4HSP70mRNA的表达情况：Levene检验方差齐性(F=1.040,P=0.395),采用LSD法检验。各组间比较差异具有统计学意义(F=35.778,P=0.000)。空白组HSP70mRNA表达最低,模型组略高于空白组(P=0.123),但无统计学意义；西药组、中药低剂量、中药高剂量组均高于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),有统计学意义；西药组、中药高剂量组表达高于中药低剂量组(P=0.001,P=0.003),有统计学意义；西药组、中药高剂量组表达差异无统计学意义(P=0.604)。3.5血清IL-1β、IL-10：血清IL-1β、IL-10指标各组之间比较：①IL-1p含量：Levene检验方差不齐(F=8.109,P=0.000),采用Welch法近似方差分析。各组间IL-1p含量比较,差异有统计学意义(F=341.297,P=0.000)。组间两两比较,模型组高于正常组、西药组、中药高、低剂量组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000)。西药组与中药高低于中药低剂量组(P=0.000,P=0.000),差异具有统计学意义。西药组与中药高剂量组相比差异无统计学意义(P=1.000)。②IL-10含量：Levene检验方差不齐(F=4.938,P=0.002),采用Welch法近似方差分析。各组间IL-10含量比较,差异有统计学意义(F=47.969,P=0.000)。组间两两比较,模型组低于空白组、西药组、中药高、低剂量组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000)；西药组与中药高剂量组均高于中药低剂量组比较(P=0.017,P=0.011),差异具有统计学意义。西药组与中药高剂量组相比差异无统计学意义(P=1.000)。4、结论1.HSP70作为一种保护因子可减轻急性痛风性关节炎的炎症损伤；2.痛风宁治疗急性痛风性关节炎明确有效,诱导体内HSP70的高表达是其治疗急性痛风性关节炎的重要作用途径之一。