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目的:克隆人HLX(H2.0-like homeobox gene,HLX)基因,原核表达并纯化HLX蛋白;制备针对人HLX融合蛋白的兔源性多克隆抗体并加以鉴定;定量PCR检测胃癌病人外周血单个核细胞中HLX mRNA的表达水平,以探讨HLX基因表达水平对机体Th1/Th2平衡状态的影响及其与胃癌发生发展的关系。方法:(1)采用RT-PCR方法从人脐血单个核细胞获得HLX基因,克隆至pMD19-T载体,转化E.coli DH5α宿主菌,挑取菌落进行酶切鉴定,将初步确定的阳性克隆进一步测序确认。(2)以PCR的方法从HLX阳性克隆中获得HLX基因的ORF区全长,连接至pQE30原核表达载体,转化E.coli DH5α宿主菌,挑取菌落进行酶切和测序鉴定。(3)将阳性重组质粒pQE30-HLX转化入E.coli M15菌中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,所表达的HLX融合蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。大量诱导表达HLX融合蛋白,利用Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱分离纯化,以HLX蛋白作为抗原免疫家兔,收集含抗HLX多克隆抗体的兔血清,并用ELISA和Westernblot法鉴定抗体的效价和特异性。(4)定量PCR检测胃癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells,PBMC)中HLX的表达,并与健康对照组进行比较研究,同时分析胃癌患者HLX的表达与T-bet、GATA-3表达的关系,以从转录因子水平了解可能存在于胃癌患者机体的Th1/Th2平衡失调状态。结果:(1)成功克隆了人HLX基因,构建了pMD19-T-HLX质粒。(2)成功克隆人HLX基因ORF区全长,构建pQE30-HLX原核表达质粒。测序结果显示,连接至pQE30载体的目的片段为HLX的ORF区,全长1467bp,编码488个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致。经诱导和纯化获得HLX融合蛋白,大小约为55kD。(3)成功制备了针对人HLX蛋白的多克隆抗体,经ELISA和Western blot鉴定,具有良好的反应性及特异性,也表明HLX融合蛋白具有良好的免疫原性。(4)实时荧光定量PCR检测了胃癌患者PBMC的HLX表达水平,较之健康对照组,其表达量有所下降。同法检测了胃癌患者T-bet、GATA-3表达的情况,分析了与两种基因间的相关性。结论:成功构建了pQE30-HLX原核表达质粒并在大肠埃希菌中有效表达;获得人HLX融合蛋白,并以此为抗原,制备了特异性多克隆抗体;检测了HLX在胃癌患者PBMC的表达水平,较之健康对照组有所下降,并其表达水平与其他Th1型细胞因子或转录因子T-bet呈正相关,与GATA-3呈负相关,推测其可能与胃癌的发生发展存在一定的关系。