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骨质疏松症是一种因骨量低下,骨微结构破坏,导致骨脆性增加,易发骨折为特征的全身性骨病。[1]。该疾病在女性主要由绝经后雌激素下降引起,主要表现为骨形成的减少[2]。全球范围内约有2亿人正在经受骨质疏松的痛苦[3],同时,约50%的65岁以上绝经后高加索或亚洲女性经历骨质疏松引起的骨折[4]。近几年,多项研究显示,由于破骨细胞数目的增加及雌激素的减少,绝经后骨质疏松女性的骨折愈合时间延长。目前,药物治疗骨质疏松主要分为全身给药和局部药物缓释,应用的药物包括抗骨吸收类如雌激素替代疗法(HRT)、选择性雌激素受体调节剂(SEM)、双膦酸盐(Bisphosphates)和降钙素(Calcitonin),促骨形成类如甲状旁腺激素类(PTH1-3和PTH1-84)及氟化物(Fluoride),和兼有抗吸收及促形成作用的药物如雷尼酸锶(Strontium ranelate) [5]。尽管这些药物在临床上广泛应用于治疗骨质疏松及其伴发的骨折,对于骨质疏松状况下的局部骨缺损再生修复的研究更值得关注,特别是生物支架材料的植入对局部骨缺损愈合的疗效。丝素的主要由p-片层结构的纤维多肽组成,其主要成分包括甘氨酸、丙氨酸和丝胶[6]。天然丝素来源于蚕丝,通过基因工程技术或对丝素经过一系列的化学改性,形成可用于生物医学研究的丝蛋白[7]。丝蛋白因其诸多优点,例如质轻、可降解、高张力、高韧性、价格低廉和易于加工处理等,可制备成复合丝蛋白支架应用于韧带纤维、骨和软骨组织再生方面的研究[8,9]。体内和体外研究证明了丝素的各种生物和化学性能,包括低生物毒性、非炎性反应、非免疫原性、生物可降解性和生物吸收性等。相应地,研究者们将丝蛋白支架作为药物控释载体或种子细胞生长模板,广泛地应用于骨组织工程领域,然而,与陶瓷类支架相比,纯丝蛋白支架的骨引导性较差。相对而言,陶瓷类(例如磷酸钙和生物玻璃)支架作为生物骨替代材料广泛应用于口腔科和矫形骨科,这得力于它们与天然矿化骨有着极相似的无机成分、结构和机械性能[10]。磷酸钙(CaP)具有较高的蛋白亲和性,无机离子降解后形成再矿化层沉积于骨组织和支架材料之间,以增强骨与胞外基质界面的结合强度[11]。另外,生物玻璃(BGs)被称作原位组织再生修复的第三代生物材料,能够同时直接结合骨组织和软组织[12]。BGs能释放钠离子和钙离子,形成的羟基磷酸钙沉积层利用强化学键紧密地结合玻璃层和宿主骨组织,进而刺激新骨生成[13]。再者,生物玻璃类的新兴衍生物——介孔生物玻璃(MBGs),因其高度的表面改性和多孔性,相比传统BGs呈现出更优越的生物活性。体外细胞学实验发现,MBGs界面释放的硅、钙、磷和钠离子迅速提高胞外和胞内反应,极大提高其在生物医学科学领域的应用价值[14]。综上,我们设计和实施了如下三个实验来探讨以上问题：(1)首先实施大鼠卵巢摘除术建立骨质疏松动物模型,选用同月龄的正常大鼠为对照,研究和比较MBGs/丝蛋白支架和BGs/丝蛋白支架对骨髓问充质细胞的生物学影响,包括黏附、增殖和成骨向分化等；(2)进一步针对骨质疏松状况下的大鼠建立股骨缺损模型,比较MBGs/丝蛋白支架和BGs/丝蛋白支架对缺损局部区域的再生修复作用,包括骨形成和矿化、骨基质的成熟、再生骨形成过程中的软骨成骨和破骨活性等方面；(3)同时,运用相同的体内动物模型,研究CaP/丝蛋白支架对缺损局部区域的再生修复作用,包括骨形成和矿化、骨基质的成熟、再生骨形成过程中的软骨成骨和破骨活性等方面。第一部分 比较介孔生物玻璃(MBG)与非介孔生物玻璃(BG)/丝蛋白支架对骨质疏松来源骨髓基质细胞的影响目的：研究MBG与BG/丝蛋白复合支架作为细胞载体,对于正常大鼠及骨质疏松诱导模型来源BMSCs增殖和成骨分化能力的影响材料和方法：选取3月龄Wistar大鼠行双侧卵巢摘除术,经2个月诱导期,行μCT重建分析、HE染色和Alizarin Red染色,鉴定骨质疏松模型的成功建立。选取同月龄正常大鼠为对照,分离、培养骨质疏松来源BMSCs并接种于三维丝蛋白支架,行SEM观察接种后细胞形态,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖,PNPP法检测成骨诱导分化后细胞的ALP活性。结果：μCT结果显示,与假手术组相比,骨质疏松组股骨头局部松质骨BV/TV,Tb.N和Tb.Th均显著降低,Tb.Sp增高,股骨干皮质骨厚度降低。分离的骨质疏松大鼠原代MSCs (O-MSCs)在培养12天后细胞密度达到80%以上,而正常大鼠来源MSCs (S-MSCs)仅需9天达到同样生长密度。成骨诱导14天后,Alizarin Red染色显示O-MSCs组的结节数明显少于S-MSCs组,说明骨质疏松来源的MSCs的成骨能力下降。HE染色观察骨组织形态,骨质疏松大鼠松质骨的骨量下降、骨质结构破坏,骨内膜吸收引起皮质骨厚度减少,进而显现骨髓腔增大。结论：成功建立本课题所需的大鼠骨质疏松模型。MBG/丝蛋白支架有利于骨质疏松来源O-MSCs和正常大鼠S-MSCs的黏附、增殖和成骨诱导分化,可考虑用于体内骨缺损模型。第二部分比较介孔生物玻璃(MBG)与非介孔生物玻璃(BG)／丝蛋白支架对骨质疏松状态下骨缺损再生修复的影响目的：探讨与比较MBG与BG/丝蛋白复合支架在骨质疏松状态下股骨缺损的改建过程及再生修复效果。材料和方法：对Wistar大鼠行双侧卵巢摘除术,骨质疏松模型建立后,制备股骨远端2.5mm直径的穿通缺损,植入纯丝支架、BG/丝蛋白支架和MBG/丝蛋白支架,并设缺损无充填组为对照。术后14和28天,行μCT重建分析、HE染色、Safranin O染色、TRAP染色(N.Oc)和免疫组化(COL I, OPN, BSP and OCN)检测分析。结果：结合μCT结果、组织学观察和细胞学行为确立骨质疏松动物模型建立成功。术后第二周和第四周,缺损无充填组无法自行愈合,结合组织形态学和μCT定量分析,其余实验组再生骨量为MBG/丝蛋白组>BG/丝蛋白组>纯丝支架组。免疫组化检测成骨指标COL I, OPN, BSP和OCN,结果显示MBG/丝蛋白组能显著诱导胶原和非胶原基质的合成。结论：本研究结果提示,与纯丝蛋白支架和BG/丝蛋白支架相比,MBG/丝蛋白支架能加快骨质疏松状况下骨缺损的愈合进程,尽管该病理过程本身呈现显著的骨质破坏和骨量减少。同时,MBG/丝蛋白支架能更快地诱导成骨矿化并减少破骨活力。综合以上结论,MBG/丝蛋白支架可用于绝经后骨质疏松状况下局部骨质缺损得修复,是具有潜在治疗作用和临床应用价值的骨替代物。第三部分多孔磷酸钙(CaP)/丝蛋白支架对骨质疏松状态下骨缺损再生修复的影响目的：探讨多孔CaP/丝复合支架在骨质疏松状态下股骨缺损的改建过程及再生修复效果。材料和方法：对Wistar大鼠行双侧卵巢摘除术,骨质疏松模型建立后,制备股骨远端2.5mm直径的穿通缺损,植入多孔CaP/丝复合支架,并设空白组、缺损无充填组和纯丝支架组为对照。术后14和28天,行μCT重建分析、HE染色、Safranin O染色、TRAP染色(N.Oc)和免疫组化(Col I和OPN)检测分析。结果：结合μCT结果、组织学观察和体重变化确立骨质疏松动物模型建立成功。术后14和28天,缺损无充填组无法自行愈合。多孔CaP/丝支架组的BV/TV、骨再生指数、Col I和OPN的表达明显高于纯丝支架组,且支架残余量、N.Oc显著降低,愈合过程中可见纤维骨结构和软骨基质的形成。结论：基于组织工程途径的多孔CaP/丝复合支架对骨质疏松状态下的缺损修复治疗具有优越性和广阔的应用前景,为病理状态下的骨再生修复提出新的治疗思路。