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目的:通过经口灌胃给药法制备活络骨康丸家兔含药血清,将其用于培养全骨髓法提取的骨髓基质细胞(Marrow Stromal Cells,MSCs),观察其对MSCs成脂与成骨分化机制的影响,探讨活络骨康丸家兔含药血清对酒精诱导MSCs成脂抑制及促进成骨的作用机理。进一步证明活络骨康丸防治酒精性股骨头坏死(Osteonecrosis of Femoral Head,ONFH)的有效性与可行性,为该药在临床上应用于治疗此病提供科研依据和理论支持。方法:实验选用新西兰大白兔10只,依据体表面积折算动物等效药量法,计算活络骨康丸灌胃剂量,以2 ml/Kg溶剂量换算,将丸剂碾末后置入生理盐水内均匀混悬,配制成药液。连续经口灌胃7天后(每日上午1次),剖腹取家兔腹主动脉血用以制成活络骨康丸家兔含药血清。应用全骨髓贴壁法体外分离培养以获得家兔MSCs,后接种于6孔培养板内,每板分3组(2孔/组)于接种当天即进行干预实验。其中,对照组低糖型DMEM培养液中加入的是10%正常家兔血清;模型组培养液中加入10%正常家兔血清及90 mmol/L酒精;实验组培养液中则加入10%活络骨康丸家兔含药血清及90 mmol/L酒精。干预性培养后,分别从成脂指标[苏丹Ⅲ脂染及光镜下脂肪cell计数和反复冻融法裂解MSCs所得细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量]和成骨指标[MSCs胞内碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性及细胞培养液中骨钙素(Bone Gla Protein,BGP)含量]两方面进行观察记录及相应定性定量检测。实验第12天,将部分培养板内细胞刮落并收集,反复冻融使胞膜破裂,离心取上层清液,后将试剂盒置于全自动生化分析仪上测定细胞内ALP活性;第14天,采用放射免疫检测技术测定细胞培养液内BGP含量;待培养至第21天,取出6孔板各孔内供脂染样本预置的盖玻片,进行苏丹Ⅲ染色处理,倒置相差显微镜下观察脂肪滴颜色、形态、大小等,并完成脂肪cell计数。反复冻融法裂解细胞,收集并测定培养液中TG含量。所得数据均应用SPSS 22.0统计分析软件进行处理。结果:(1)细胞培养至第12~14天,置于倒置显微镜下观察到模型组和实验组细胞胞浆内均开始出现微小颗粒状呈圆形的脂肪滴,类似液泡且周围具有折光性黑色环。但实验组中数量相对较少,而对照组中最少。继续培养并观察,随着酒精刺激MSCs脂肪分化特性进一步增强,脂肪cell数量逐渐增多,细胞内微小脂滴逐渐融合致体积明显变大,镜下观察为多边形或类圆形。待培养至第21天,苏丹Ⅲ染色处理后,见细胞内出现被染为橘红色颗粒状小圆脂滴,细胞核则被染为浅蓝色。(2)脂肪cell计数和胞内TG含量提示模型组显著高于实验组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)模型组测得ALP活性及BGP含量均明显低于实验组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:酒精毒性作用可使股骨头内脂肪cell增殖肥大,脂质沉积、脂代谢紊乱而使骨细胞变性坏死,成骨细胞亦出现失活,导致ONFH。活络骨康丸家兔含药血清对酒精诱导MSCs具有成脂抑制作用,同时能促进并维持MSCs成骨分化,对抗酒精毒性,改善局部微循环,降低股骨头骨内压,促进死骨修复和新骨生成,对酒精性ONFH具有防治作用。