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[研究背景]鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种好发于东南亚地区及我国南方各省的常见恶性肿瘤。鼻咽癌患者放疗后局部的复发以及远处转移是制约其疗效和预后的瓶颈,放射抗拒是制约鼻咽癌患者5年生存率的关键因素。有研究表明,辐射诱导的基因调控和表达的差异可能与放射抗拒的发生有关。因此,寻找能够早期预测鼻咽癌辐射敏感性的分子标志物对于个体化放射治疗具有重要意义。本课题组将前期筛选出与放射抗拒相关的分子标志物进行基因本体论(gene ontology)、通路分析(Pathway analysis)及蛋白质互做网络技术(Protein interaction network)进行综合分析,从放射抗拒相关基因或蛋白质互做网络中获取多个与辐射抗拒相关的关键性标志物。我们选取在通路构建网络上的节点之一的c-jun作为候选基因,为明确c-jun基因与鼻咽癌放射抗拒之间的相关性,我们利用对RNA干扰技术抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,探究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响及其潜在机制。初步探讨c-jun基因能否成为鼻咽癌分子治疗的新靶点。研究内容第一部分慢病毒shRNA载体构建并建立稳定转染的CNE-2R细胞株[目的]本课题组前期发现c-jun基因在放射抗拒细胞株CNE-2R中呈高表达,因其涉及多条通路且是基因互作网络中的关键节点之一,为明确c-jun基因与鼻咽癌放射抗拒之间的相关性,我们利用RNAi抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,并筛选稳定表达的细胞株,为探究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响奠定基础。[方法]1.采用RT-PCR及Western blot实验分别在mRNA及蛋白水平上验证c-jun基因的表达。2.设计合成3组特异性针对c-jun基因的siRNA,构建慢病毒shRNA载体,感染CNE-2R细胞。3.将感染目的细胞CNE-2R,经流式分选获得稳定的细胞株,采用RT-PCR和Western blot实验检测各组对目的基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的靶点。[结果]1. RT-PCR和Western blot实验检测c-jun基因的表达情况与芯片结果相符。2.经测序证实,3组特异性针对c-jun基因的siRNA,成功构建慢病毒shRNA载体,并包装出滴度为8×108TU/ml。感染CNE-2R细胞,荧光倒置显微镜下观察,显示各组感染效率均在80%以上,感染成功。3. RT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰靶点,siRNA序列为：CAAACCTCAGCAACTTCAA。[结论]RNA干扰技术可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,为后续实验奠定基础。第二部分慢病毒-介导的C-jun基因沉默对放射抗拒人鼻咽癌CNE-2R细胞生物学行为及放射敏感性的影响[目的]利用RNA干扰技术抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,观察c-jun基因沉默后对CNE-2R细胞的存活能力、周期、凋亡及放射敏感性的影响,了解c-jun基因与鼻咽癌放射敏感性间的相关性。[方法]1.CCK-8实验检测感染前后细胞的生长情况,分析c-jun基因沉默前后对CNE.2R细胞生存率的影响。2.克隆形成实验测定c-jun基因沉默前后,CNE-2R细胞放射敏感性的变化。3.流式细胞术检测经0 Gy和2 Gy处理后各组细胞周期及凋亡率的变化,分析c-jun基因沉默后对CNE-2R细胞周期及凋亡的影响。[结果]1.CCK-8实验结果显示：6MV X射线联合c-jun基因沉默组在0、2、4、6和8 Gy照射后细胞的吸光度OD值均显著低于未转染组和阴性对照组(F=42.70～200.67,P<0.05)。2.克隆形成实验显示,c-jun基因沉默组与未转染组及阴性对照组相比,SF2、D0和Dq值均减小,放射增敏比(SERD0)为1.41。3.细胞周期结果显示：0Gy：未转染组、NC组和c-jun-RNAi-LV2实验组G2/M所占比例分别为18.27±5.28,17.13±3.35,27.33±1.58,c-jun基因沉默组与另两组相比G2/M所占比例增加(P<0.05)；2Gy：三组G2/M所占比例分别为19.93+4.99,17.634±3.01,28.57±2.9(P<0.05)。4.细胞凋亡实验结果显示,未经照射的c-jun基因沉默组与联合2 Gy照射的凋亡率分别为(20.93+1.99)%和(38.17±0.83)%,均高于未转染组和阴性对照组的凋亡率[0 Gy;(10.97±0.70)%和(10.80±1.25)%；2 Gy：(20.43±0.25)%和(19.53+1.50)%；F=50.54、330.14,P<0.05]。[结论]c-jun基因可能通过抑制细胞增殖,诱导凋亡,从而增强CNE-2R细胞的放射敏感性,提示c-jun可能成为提高鼻咽癌放射敏感性的潜在靶点。