论文部分内容阅读
目的：从皖南地区眼镜蛇毒粗毒中分离纯化出活性组分（cobra venom analgesicfactor， CVAF）；并对其镇痛效应及可能机制进行初步研究。方法：1、采用蛋白质纯化平台AKTA prime全自动分析仪，用阳离子交换色谱（IEC，ion exchangechromatography）和排阻层析（SEC，size exclusion chromatography）分离纯化皖南地区眼镜蛇毒粗毒，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效毛细管区带电泳法进行纯度及相对分子量的鉴定，测定镇痛组分的LD50；形态学观察各主要脏器变化；2、采用小鼠热板法和醋酸扭体法，以吗啡作为阳性对照，评估CVAF的镇痛效应；用不同拮抗剂（纳洛酮、阿托品和L-NAME）干预后，观察镇痛组分在热板法模型中的镇痛作用，并进一步探讨其可能镇痛机制；3、建立完全弗氏佐剂（CFA）炎性痛大鼠模型（CFA group），以吗啡作为阳性对照，采用热痛法和机械压痛法测定CVAF对炎性痛模型大鼠热痛阈潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）和机械压痛阈值（mechanical withdrawalthreshold，MWT）的影响；同时检测脊髓匀浆IL-1、TNF-α含量；经不同拮抗剂干预后，观察CVAF在炎性痛模型中的镇痛作用，并探讨其可能镇痛机制；结果：1、皖南地区眼镜蛇毒粗毒经过两步纯化后得到活性产物CVAF经鉴定为单一组分，相对分子量为6500Da；LD50为0.6289mg/kg；2、0.03mg/kg、0.1mg/kg和0.3mg/kg的活性组分CVAF在扭体法测定中小鼠扭体抑制率分别为27%、50%、70%；0.3mg/kg CVAF组与吗啡组相比无显著差异（P>0.05）；通过小鼠热板法测定显示，活性组分CVAF自用药后0.5h开始有镇痛作用，该作用持续8h仍存在。在此基础上，通过腹腔注射胆碱能受体阻断药阿托品（5mg/kg）或阿片受体阻断剂纳洛酮（4mg/kg）后，小鼠热板法测定显示CVAF的镇痛作用均有一定程度的逆转；非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME可增强CVAF的镇痛作用；3、与NC组相比，CFA组大鼠第1天开始TWL和MWT明显降低，出现热痛觉过敏和机械痛觉过敏，持续14天仍存在；CFA组大鼠脊髓匀浆IL-1和TNF-α表达均明显增高（P <0.01）。与CFA组相比，CFA组大鼠腹腔注射CVAF后其TWL和MWT均升高，表明炎性痛大鼠热痛觉过敏和机械痛觉过敏得到改善；脊髓匀浆中IL-1、TNF-α表达显著减少（P <0.01），显示CVAF通过抑制炎性因子的产生而发挥镇痛作用。炎性痛大鼠分别腹腔注射拮抗剂（阿托品；纳洛酮；L-NAME）30min后，再腹腔注射CVAF，行为学测定结果表明：与CFA+CVAF组相比，CFA+L-NAME+CVAF组大鼠TWL和MWT明显升高（P <0.01），提示NO合酶抑制剂和CVAF之间存在一定的相互作用；使用阿托品或纳洛酮均可逆转CVAF对CFA组大鼠TWL和MWT的升高作用（P <0.01）；提示阿片肽受体系统和胆碱能受体系统可能均部分参与了CVAF对炎性痛大鼠的镇痛作用。结论：1、成功从皖南地区眼镜蛇粗毒中分离纯化出的活性产物CVAF，相对分子量为6500Da，LD50为0.6289mg/kg；2、CVAF的镇痛效应具有剂量依赖性，可能与阿片肽受体系统和胆碱能受体系统均有关；3、初步确定CVAF是通过减少炎性因子的释放而发挥镇痛作用，其镇痛作用的机制可能与阿片肽受体系统和胆碱能受体系统均有关，其确切机制有待进一步研究。