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雄性哺乳动物的睾丸是生成精子和分泌雄性激素的场所。Zfx(Zinc finger-X,Zfx)是锌脂蛋白家族成员,位于X染色体短壁上的性别决定区(TDF)内。Zfx可以作为一个较强的转录激活因子,从而引导靶基因通过核膜定位在X精子的细胞核内,可能对某些基因在X精子发生过程中具有转录激活作用,与X精子的形成发生有关。本研究根据Zfx基因m RNA序列特点,设计sh RNA片段,构建重组慢病毒骨架载体,然后进行体外细胞水平RNAi试验,q PCR分析后,筛选出对Zfx基因m RNA表达水平抑制率较高的重组载体,最后通过睾丸注射法注射给公猪,自然交配后,统计后代的性别比例,从而研究干扰Zfx基因后对猪性别控制的影响。具体研究结果如下:1、猪Zfx基因的克隆根据鼠和牛Zfx基因分段设计4对具有重叠区域的引物,采用普通PCR的方法克隆猪Zfx基因,之后用DNAMAN进行拼接,得到的猪Zfx基因序列长度为2154bp,提交到NCBI上的登录号为KF803247。2、重组慢病毒质粒干扰载体的构建根据克隆得到的猪Zfx基因m RNA序列,然后根据RNA干扰设计原则,设计并合成4对sh RNA干扰片段。再以慢病毒骨架质粒p Lenti Lox3.7(p LL3.7)作为载体,构建了4个靶向Zfx基因的sh RNA表达载体(p LL3.7/d、p LL3.7/e、p LL3.7/f、p LL3.7/g)。经过测序验证所构建的4个重组表达载体中干扰片段的序列及插入位置均正确,并且调控元件完整。说明这4个sh RNA重组表达载体构建成功,可以用于猪Zfx基因的体外干扰试验。3、将构建好的重组表达载体进行猪体外RNAi试验养殖场采回27-32日龄的仔猪睾丸,应用两步酶消化法分离出生精细胞,进行体外共培养。通过高效转染试剂盒(HET)将构建好的4个sh RNA重组表达载体分别转染生精细胞。待36-48小时后提取细胞总RNA,利用q PCR检测m RNA的表达水平。初步在细胞水平上筛选出3个干扰效果较好的sh RNA重组表达载体p LL3.7/d、p LL3.7/e、p LL3.7/f,Zfx基因的m RNA表达量分别为55%、56%、44%,与对照组相比均差异显著(P<0.05)。4、将筛选的重组表达载体进行猪体内RNAi试验选取健康公猪6头,随机分为3组,每组各2头,将用含双抗的PBS稀释的质粒p LL3.7/d、p LL3.7/e、p LL3.7/f分别注射到3组公猪睾丸内,每头3mg(1.5mg/侧),每隔9天注射一次,共注射3次,质粒p LL3.7/d在三次注射完后进行配种,而质粒p LL3.7/e和p LL3.7/f每次注射完后配种。结果显示:注射质粒p LL3.7/d组的雄性仔猪比例为69.9%,与正常的1:1性别比例相比均差异显著;分别注射质粒p LL3.7/e和p LL3.7/f的试验组,三个时间点每次配种所得的后代仔猪性别比例均差异不显著,但三个配种时间所产后代总计,p LL3.7/e的仔猪性别差异显著(P<0.05),总雄性仔猪比例为59%;p LL3.7/f差异不显著(P>0.05),雄性仔猪比例分别为49%。实验说明对Zfx基因进行干扰可以影响X精子的受精能力。