腹腔巨噬细胞对小鼠卵受精率和囊胚形成率的影响近年来子宫内膜异位症(endometriosis，EM)发病率不断上升，约5％～15％的育龄期妇女受其影响，其与不育症的关系日益成为研究的热点，但其病因与发病机制尚未完全阐明，EM患者分泌的腹腔液增多，腹腔液中巨噬细胞数量增多、功能增强，腹腔液和血清中山巨噬细胞分泌的细胞因子也明显增多，且与病变程度成正比。这些与不育是否有关、关系如何，目前尚不十分清楚。国内外的研究对巨噬细胞对囊胚形成的作用意见不一致。本研究拟通过建立小鼠体外受精模型，观察巨噬细胞对小鼠卵子受精率和囊胚形成率的影响。研究目的一．建立小鼠体外受精模型二．巨噬细胞对小鼠卵子受精率和囊胚形成率的影响1．分离、培养及鉴定小鼠腹腔巨噬细胞；2．昆明小鼠精子提取；3．昆明小鼠的药物诱导排卵；4．昆明小鼠的取卵；5．小鼠卵子与巨噬细胞体外共培养，观察其对小鼠卵受精率和囊胚形成率的影响。研究方法1．观察小鼠不同周龄(＜8周，8周～10周，10～14周和＞14周)，不同体重(<32克，32克～40克和)40克)，以及促排卵药物不同剂量(5IU、10IU和15IU)和不同状态(冷冻还是新鲜)下，所取出鼠卵的数量和质量，确定最佳的小鼠状态和药物剂量建立昆明小鼠体外诱导排卵模型。2．利用冰盐水对小鼠进行腹腔内注射，诱导腹腔巨噬细胞产生，经分离纯化，通过鉴定证明收获细胞约95％为巨噬细胞备用。3．通过设立实验组和对照组，取卵后随机把卵分成三组：①对照组，进行小鼠卵子单独培养，培养过程中不与巨噬细胞共培养；②实验组1：取卵后即与巨噬细胞进行共培养，观察巨噬细胞作为共培养体系对小鼠卵子受精率和囊胚形成过程的影响；③实验组2：在受精50小时～55小时后，即在8细胞形成前后与巨噬细胞共培养进行共培养，观察巨噬细胞作为共培养体系对小鼠受精卵囊胚形成率的影响。研究结果1．建立的标准体外受精模型，以昆明小鼠为实验材料，小鼠最佳周龄是10～14周，体重为32克～40克，所用促排卵药物以HMG10IU和HCG10IU为最佳，取卵数量最多，质量最好。2．腹腔诱导的巨噬细胞经过染色证明收获细胞约95％为巨噬细胞，且一只小鼠腹腔收获的细胞数目，如果在1个3653培养皿内池中1ml培养液里约为10~6。3．与未加巨噬细胞的对照组(受精率为91.0％)和实验组2(受精率为93.7％)比较，受精时即与巨噬细胞共培养的实验组1受精率为72.0％，明显降低，差异有统计学意义(p＜0.001)。在受精后与巨噬细胞共培养的实验组2受精卵的囊胚形成率为78.2％明显高于对照组的受精卵的囊胚形成率60.3％，差异有统计学意义(p＜0.001)。4．受精后与巨噬细胞共培养的实验组2的卵子囊胚形成率73.2％高于对照组的卵子囊胚形成率54.8％，差异具有显著的统计学意义；高于实验组1的卵子囊胚形成率50.0％，具有显著的统计学差异。5．任何一个时间点观察都发现加巨噬细胞的实验组较对照组里的细胞分裂要快，提前约7～8小时，细胞分裂质量好，碎片少，囊胚形成的时间提前。结论1．昆明小鼠的体外受精模型以10周～14周，32克～40克昆明小鼠为最佳，所用促排卵药物以HMG10IU和HCG10IU为最佳，取出的卵子数量最多质量最好。2．受精阶段与巨噬细胞共培养，可降低小鼠卵子的受精率。3．与巨噬细胞共培养对受精卵的卵裂、胚胎的生长发育和囊胚形成有明显的促进作用。4．在8细胞形成前后开始添加巨噬细胞共培养，能最大程度增加囊胚形成率。