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慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）以持续表达具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL癌蛋白为重要特征。有研究证实BCR-ABL融合蛋白的第177位酪氨酸（Y177p）自身磷酸化后，结合接头蛋白(Growth receptor bound protein2, Grb2)的SH2结构域，是最终异常激活BCR-ABL下游RAS-MAPK、PI3K-AKT信号途径，导致细胞恶性转化的关键因素。而死亡效应结构域(death effector domain,DED)在启动caspase8前体蛋白寡聚化而激活caspase8、最终导致细胞凋亡中发挥了重要作用。所以我们推测：通过外源性转导SH2-DED(SD)融合蛋白来竞争性抑制BCR-ABL Y177p与Grb2的结合，同时激活caspase8诱导细胞凋亡，可成为CML治疗的新切入点。本课题拟通过基因重组技术，将Grb2的SH2结构域与FADD的DED结构域基因融合表达，选用新近报道的用于基因治疗的腺病毒Ad5F35新型载体系统，以高表达BCR-ABL融合蛋白的CML细胞株K562细胞和KU812细胞为体外模型，探讨融合蛋白SD-HA能否通过竞争结合BCR-ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点，调控与其相关的下游信号分子活性，进而对CML细胞生长、增殖、凋亡的影响及其具体作用机制。旨在探索一种新的CML分子靶向治疗策略。采用的实验方法如下：1.重组腺病毒质粒Ad5F35-SD-HA(便于后期免疫学检测引入HA标签)和突变对照Ad5F35-SmD-HA的构建、鉴定、包装和制备高滴度病毒；荧光显微镜筛选腺病毒Ad5F35-SD-HA、Ad5F35-SmD-HA对CML细胞的感染条件及流式细胞仪分析确定感染效率；免疫细胞化学染色和激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在CML细胞内表达的亚细胞定位情况；RT-PCR及Western blot进一步分析目的蛋白SD-HA、SmD-HA在各种CML细胞内的mRNA转录水平和蛋白表达。为进一步探讨融合蛋白治疗肽SD-HA对CML的治疗作用奠定实验基础。2.通过克隆形成实验, MTT及流式细胞术检测细胞周期，观察重组腺病毒Ad5F35-SD-HA介导的融合蛋白SD-HA转导对CML细胞的特异性抑制增殖效应。通过瑞氏染色观察细胞形态及流式细胞仪检测细胞凋亡，分析重组腺病毒Ad5F35-SD-HA介导的融合蛋白SD-HA表达对CML细胞促凋亡的生物学效应。3.进一步分析融合蛋白SD-HA对CML细胞抑增殖、促凋亡效应的具体作用机制。Western blot结合免疫共沉淀技术分析融合蛋白SD-HA与BCR-ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点Y177p的相互作用，及其对BCR-ABL下游信号途径Ras-MAPK、PI3K-Akt的影响；Westernblot分析融合蛋白SD-HA对细胞膜受体死亡途径caspase级联反应的影响。通过以上实验，获得如下结果和结论：1.构建、鉴定了腺病毒Ad5F35-SD-HA、Ad5F35-SmD-HA的重组表达质粒，并将腺病毒包装、扩增，验证了其在CML细胞中的高感染率，实现了目的基因和蛋白的有效表达，明确融合蛋白SD-HA，SmD-HA在靶细胞的胞浆定位特性，为进一步研究目的蛋白SD-HA的生物学功能奠定了基础。2.验证了重组腺病毒Ad5F35-SD-HA感染CML细胞后能特异性降低CML细胞的克隆形成能力，阻滞CML细胞周期由G0/G1期向S期推进等抑制细胞的增殖效应。通过细胞形态学观察腺病毒Ad5F35-SD-HA感染CML细胞后，细胞出现空泡，核聚集和碎裂，FCM检测结果显示与对照组比较其早期凋亡细胞明显增多（p﹤0.05）等细胞凋亡的效应。3.证实了病毒载体表达SD-HA融合肽对CML细胞抑增殖和促凋亡的机制，是分别通过SH2结构域与Grb2竞争性结合BCR-ABL Y177磷酸化位点，抑制RAS和PI3K增殖信号途径；通过DED域与caspases8前体DED结构域结合而寡聚化，激活caspases8诱导的细胞凋亡信号来实现的。